PCR ဓာတ်ပစ္စည်းများ၏အစောပိုင်းအဆင့်တွင် primer နှင့် probe များ၏စွမ်းဆောင်ရည်ကိုစစ်ဆေးခြင်းနှင့်အသင့်လျော်ဆုံးတုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကိုဆုံးဖြတ်ခြင်းသည်တရားဝင်စမ်းသပ်မှုများ၏ချောမွေ့တိုးတက်မှုကိုသေချာစေရန်အတွက်ကြိုတင်လိုအပ်ချက်များဖြစ်သည်။
ဒီတော့ အစောပိုင်းအဆင့်မှာ primer probe ကို ဘယ်လိုအတည်ပြုရမလဲ။
အဓိကညွှန်းကိန်းများမှာ အခြေခံလိုင်း၊ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၊ ct တန်ဖိုး၊ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှု၊ အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသောနမူနာရှာဖွေတွေ့ရှိမှု၊ CV စသည်တို့ဖြစ်သည်။
အခြေခံအချက်
အခြေခံလိုင်းသည် PCR amplification မျဉ်းကွေးရှိ အလျားလိုက်မျဉ်းဖြစ်သည်။PCR ချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှု၏ ပထမအကြိမ်အနည်းငယ်တွင်၊ fluorescence အချက်ပြမှုသည် များစွာမပြောင်းလဲဘဲ မျဉ်းဖြောင့်တစ်ခုဖြစ်သည်။ဤမျဉ်းဖြောင့်သည် အခြေခံမျဉ်းဖြစ်သည်။
PCR primer probes များကို စစ်ဆေးသည့်အခါ အခြေခံလိုင်းသည် အဆင့်ဟုတ်မဟုတ်ကို အာရုံစိုက်ပါ။primer probe ၏ သန့်စင်မှု အာရုံစူးစိုက်မှုသည် အခြေခံလိုင်းကို မြင့်တက်ခြင်း သို့မဟုတ် ပြုတ်ကျစေခြင်းကဲ့သို့သော အခြေခံလိုင်းအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိမည်ဖြစ်သည်။အခြေခံအချက်သည် အလွန်အလိုလိုသိနိုင်သော ညွှန်ပြချက်တစ်ခုလည်းဖြစ်သည်။
Amplification Curve
နောက်ထပ် အလိုလိုသိနိုင်သော ညွှန်ပြချက်မှာ အသံချဲ့စက်၏ ပုံသဏ္ဍာန်ဖြစ်သည်။အလယ်တန်းချဲ့ထွင်ခြင်း သို့မဟုတ် အခြားပုံမှန်မဟုတ်သောချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းများကိုရှောင်ရှားရန် S-shaped မျဉ်းကွေးရှိခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။
Ct တန်ဖိုး
အခြေခံလိုင်းမှ ထပ်ကိန်းတိုးခြင်းအထိ ဖြတ်ကူးသည့်အမှတ်နှင့် သက်ဆိုင်သည့် သံသရာအရေအတွက်သည် Ct တန်ဖိုးဖြစ်သည်။
တူညီသောနမူနာအတွက်၊ မတူညီသော primer probes များသည် မတူညီသော amplification curves ကိုဖြစ်ပေါ်စေပြီး သက်ဆိုင်ရာ Ct value ကို amplification efficiency နှင့် interference degree မှ သက်ရောက်မှုရှိမည်ဖြစ်ပါသည်။သီအိုရီအရ၊ ကျွန်ုပ်တို့ရွေးချယ်သော primer probe ၏ Ct တန်ဖိုးသေးငယ်လေ၊ ပိုကောင်းလေဖြစ်သည်။
ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်
PCR ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် ယုံကြည်စိတ်ချရဆုံးနှင့် တည်ငြိမ်သောနည်းလမ်းများထဲမှတစ်ခုမှာ သုတေသီများက ကျယ်ပြန့်စွာအသိအမှတ်ပြုထားသည့် စံမျဉ်းကွေးဖြစ်သည်။နည်းလမ်းသည် ပစ်မှတ် နမူနာပုံစံများ ၏ ဆွေမျိုးအရေအတွက်ကို ထိန်းချုပ်ရန် နမူနာများ အတွဲလိုက် ပြုလုပ်ခြင်း ပါဝင်သည်။ဤနမူနာများကို အများအားဖြင့် စုစည်းထားသော စတော့ခ်ဖြေရှင်းချက်များ၏ နံပါတ်စဉ် အရောအနှောများဖြင့် ပြုလုပ်ထားကာ အသုံးအများဆုံးမှာ 10-fold dilution ဖြစ်သည်။Cq တန်ဖိုးကိုရရှိရန် စံပြ qPCR ပရိုဂရမ်ကို အသုံးပြု၍ အရောအနှောများကို အသုံးပြုကာ နောက်ဆုံးတွင် နမူနာတစ်ခုစီ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် ဆက်စပ်သော Cq တန်ဖိုးအလိုက် မျဉ်းကြောင်းညီမျှခြင်း Cq= -klgX0+b နှင့် ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှု E=10(-1 /k)-1 ကိုရရှိရန် စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုဆွဲပါ။အရေအတွက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် qPCR ကိုအသုံးပြုသောအခါ၊ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုသည် 90% မှ 110% (3.6>k>3.1) အကွာအဝေးတွင်ရှိရန် လိုအပ်သည်။
အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသော နမူနာများကို ထောက်လှမ်းခြင်း။
နမူနာအာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသောအခါ၊ မတူညီသော primer probes များ၏ ထောက်လှမ်းမှုနှုန်းများသည် မတူညီပါ။ပုံတူပွားရန် ကျွန်ုပ်တို့သည် အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသောနမူနာ 20 ကိုရွေးချယ်ကာ အမြင့်ဆုံးထောက်လှမ်းမှုနှုန်းဖြင့် primer-probe စနစ်သည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။
ပြောင်းလဲခြင်း၏ကိန်းဂဏန်း (CV)
nucleic acid amplification detection အတွက် reagent ၏ မျဉ်းစံနှုန်းအရ မိတ္တူနမူနာ 10 ခုကို မတူညီသော primer probes များဖြင့် ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်ပါသည်။
အရေအတွက် ဓါတ်ပြုပစ္စည်းများ-
တိကျမှု
အသုတ်တစ်ခုအတွင်း တိကျမှုသည် ပြည့်မီသင့်သည်- စမ်းသပ်မှု၏ လော့ဂရစ်သမ်တန်ဖိုး၏ ကွဲလွဲမှု၏ကိန်းဂဏန်း (CV,%) သည် ≤5% ဖြစ်သည်။နမူနာအာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသောအခါ၊ ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုအာရုံစူးစိုက်မှု၏ logarithm ၏ကွဲလွဲမှုကိန်းဂဏန်း (CV,%) သည် ≤10% ဖြစ်သည်။
အရည်အသွေးရှိသော ဓာတ်ပစ္စည်းများ-
တိကျမှု
အသုတ်တစ်ခုအတွင်း တိကျမှု ပြည့်မီရမည်-
(1) Ct တန်ဖိုး၏ ကွဲလွဲမှု Coefficient (CV,%) ≤5%
တူညီသောနမူနာကို 10 ကြိမ်အပြိုင်စမ်းသပ်ပြီး စစ်ဆေးမှုရလဒ်များသည် တစ်သမတ်တည်းဖြစ်သင့်သည်။
ပို့စ်အချိန်- စက်တင်ဘာ-၁၈-၂၀၂၁
