Fluorescence quantitative PCR (နောက်မှ TaqMan PCR ဟုလည်းခေါ်သည်၊ FQ-PCR ဟုရည်ညွှန်းသည်) သည် အမေရိကန်ပြည်ထောင်စုတွင် PE (Perkin Elmer) မှ 1995 ခုနှစ်တွင် တီထွင်ခဲ့သော နူကလိစ်အက်ဆစ်ပမာဏနည်းပညာအသစ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ဤနည်းပညာသည် သမရိုးကျ PCR ပေါ်တွင် အခြေခံထားသည့် fluorescent တံဆိပ်တပ်ထားသော probes များကိုထည့်သွင်းထားသည်။လိုက်လျောညီထွေရှိသော PCR နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက FQ-PCR သည် ၎င်း၏ အရေအတွက်ဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်ချက်ကို သိရှိနားလည်ရန် အားသာချက်များစွာရှိသည်။ဤဆောင်းပါးသည် နည်းပညာ၏ဝိသေသလက္ခဏာများ၊ အခြေခံမူများ၊ နည်းလမ်းများနှင့် အသုံးချမှုများကို အကျဉ်းချုံးဖော်ပြရန် ရည်ရွယ်ပါသည်။
အင်္ဂါရပ်များ ၁
FQ-PCR သည် သာမန် PCR ၏ မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းရှိရုံသာမက fluorescent probes များအသုံးပြုခြင်းကြောင့်လည်း PCR amplification တွင် photoelectric conduction system မှတစ်ဆင့် quantitative results ကိုရရှိရန် photoelectric conduction system မှတစ်ဆင့် fluorescent signal ကို တိုက်ရိုက်ထောက်လှမ်းနိုင်ပြီး၊ သမားရိုးကျ PCR ၏ ချို့ယွင်းချက်များစွာကို ကျော်လွှားနိုင်သောကြောင့် ၎င်းသည် DNA မြင့်မားသောနည်းပညာနှင့် ရောစပ်ထားသောနည်းပညာ၏ မြင့်မားသောတိကျမှုရှိပါသည်။
ဥပမာအားဖြင့်၊ ယေဘူယျ PCR ထုတ်ကုန်များကို ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်ဖြင့် agarose gel electrophoresis နှင့် ethidium bromide စွန်းထင်းခြင်း သို့မဟုတ် polyacrylamide gel electrophoresis နှင့် silver staining တို့ဖြင့် စောင့်ကြည့်ရန် လိုအပ်ပါသည်။၎င်းသည် တူရိယာများစွာ လိုအပ်ရုံသာမက အချိန်နှင့် ကြိုးစားအားထုတ်မှုလည်း လိုအပ်သည်။Ethidium bromide အသုံးပြုထားသော အစွန်းအထင်းများသည် လူ့ခန္ဓာကိုယ်အတွက် အန္တရာယ်ရှိပြီး ဤရှုပ်ထွေးသော စမ်းသပ်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်းများသည် ညစ်ညမ်းမှုနှင့် မှားယွင်းသောအပြုသဘောများအတွက် အခွင့်အလမ်းများကို ပေးဆောင်သည်။သို့သော်၊ FQ-PCR သည် နမူနာတင်နေစဉ်အတွင်း အဖုံးကို တစ်ကြိမ်သာဖွင့်ရန် လိုအပ်ပြီး နောက်ဆက်တွဲလုပ်ငန်းစဉ်သည် PCR လုပ်ငန်းစဉ်လွန်လုပ်ဆောင်ခြင်း မလိုအပ်ဘဲ၊ သမားရိုးကျ PCR လုပ်ဆောင်ချက်များတွင် အားနည်းချက်များစွာကို ရှောင်ရှားနိုင်သည့် နောက်ဆက်တွဲလုပ်ငန်းစဉ်သည် လုံးဝအပိတ်ပြွန်လည်ပတ်မှုဖြစ်သည်။စမ်းသပ်ချက်သည် ယေဘူယျအားဖြင့် PE ကုမ္ပဏီမှ ထုတ်လုပ်သော ABI7100 PCR အပူစက်ဘီးကို အသုံးပြုသည်။
ကိရိယာတွင် အောက်ပါလက္ခဏာများ ပါရှိသည်- ① ကျယ်ပြန့်သော အသုံးချမှု- DNA နှင့် RNA PCR ထုတ်ကုန်အရေအတွက်၊ မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုဆိုင်ရာ သုတေသန၊ ရောဂါပိုးရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနှင့် PCR အခြေအနေများကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ရန်အတွက် အသုံးပြုနိုင်သည်။② ထူးခြားသောပမာဏနိယာမ- fluorescently တံဆိပ်တပ်ထားသော probes များကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့် quantification ၏ရည်ရွယ်ချက်ကိုအောင်မြင်ရန်အတွက် laser excitation ပြီးနောက် PCR လည်ပတ်မှုနှင့်အတူ fluorescence ပမာဏသည် စုပုံလာမည်ဖြစ်သည်။③ မြင့်မားသောလုပ်ငန်းခွင်ထိရောက်မှု- 9600 PCR အပူစက်ဘီးတပ်ဆင်ထားသော၊ ကွန်ပျူတာသည် 1 မှ 2 နာရီအထိ ချဲ့ထွင်ခြင်းနှင့် အရေအတွက် 96 နမူနာများကို အလိုအလျောက်နှင့် တပြိုင်နက်တည်း ပြီးမြောက်စေရန် ထိန်းချုပ်ထားသည်။④ gel electrophoresis မလိုအပ်ပါ- နမူနာအား ပျော့ပျောင်းပြီး electrophoresis ပြုလုပ်ရန် မလိုအပ်ပါ၊ တုံ့ပြန်မှုပြွန်အတွင်း တိုက်ရိုက်ထောက်လှမ်းရန် အထူးစုံစမ်းထောက်လှမ်းကို အသုံးပြုပါ။⑤ ပိုက်လိုင်းအတွင်း ညစ်ညမ်းမှု မရှိပါ- ထူးခြားသော အပြည့်အ၀ အလုံပိတ် တုံ့ပြန်မှုပြွန်နှင့် photoelectric conduction စနစ်တို့ကို လက်ခံထားသောကြောင့် ညစ်ညမ်းမှုအတွက် စိတ်ပူစရာ မလိုပါ။⑥ ရလဒ်များသည် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သည်- အရေအတွက် ဒိုင်နမစ်အကွာအဝေးသည် ပြင်းအားငါးခုအထိရှိသည်။ထို့ကြောင့် ဤနည်းပညာကို အောင်မြင်စွာ တီထွင်နိုင်ခဲ့သောကြောင့် ၎င်းကို သိပ္ပံသုတေသီများစွာက တန်ဖိုးထားပြီး နယ်ပယ်များစွာတွင် အသုံးချခဲ့သည်။
2 အခြေခံများနှင့် နည်းလမ်းများ
FQ-PCR ၏လုပ်ငန်းဆောင်တာနိယာမမှာ PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်သို့ fluorescently labeled probe ကိုထည့်ရန် Taq အင်ဇိုင်း၏ 5′→3′ exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်ကို အသုံးပြုရန်ဖြစ်သည်။စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုသည် primer အစီအစဥ်တွင်ပါရှိသော DNA ပုံစံဖြင့် အတိအကျ ပေါင်းစပ်နိုင်သည်။စုံစမ်းစစ်ဆေးမှု၏ 5′ စွန်းကို fluorescence emission gene FAM (6-carboxyfluorescein၊ fluorescence emission peak at 518nm) ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားပြီး 3′end ကို The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine 5 the fluorescence emission3′, the fluorescence3′၊ PCR ချဲ့ထွင်နေစဉ်အတွင်း probe ကို တိုးချဲ့ခြင်းမှ ကာကွယ်ရန် phosphorylated ။probe သည် နဂိုအတိုင်းရှိနေသောအခါ၊ quencher group သည် emission group ၏ fluorescence emission ကို ဖိနှိပ်သည်။ထုတ်လွှတ်သည့်အုပ်စုကို quenching အုပ်စုမှ ခွဲထုတ်လိုက်သည်နှင့်၊ တားဆီးမှုကို ရုတ်သိမ်းလိုက်ပြီး၊ 518nm တွင် optical သိပ်သည်းဆ တိုးလာကာ fluorescence detection system မှ ရှာဖွေတွေ့ရှိပါသည်။ ပြန်ပြောင်းသည့်အဆင့်တွင်၊ probe သည် ပုံစံပလိတ် DNA နှင့် ပေါင်းစပ်ကာ၊ တိုးချဲ့မှုအဆင့်ရှိ Taq အင်ဇိုင်းသည် DNA template ၏ extension အတိုင်း ရွေ့လျားသည်။probe ကို ဖြတ်လိုက်သောအခါ၊ quenching effect ထွက်လာပြီး fluorescent signal ထွက်လာသည်။ပုံစံပလိတ်ကို ကူးယူသည့်အခါတိုင်း၊ fluorescent အချက်ပြမှုထုတ်လွှတ်မှုနှင့်အတူ ပရိုဘ်ကို ဖြတ်တောက်သည်။ထုတ်လွှတ်သော fluorophores အရေအတွက်နှင့် PCR ထုတ်ကုန်အရေအတွက်တို့အကြား တစ်ဦးမှတစ်ဦး ဆက်စပ်မှုရှိသောကြောင့်၊ ပုံစံပလိတ်ကို တိကျစွာရေတွက်ရန် ဤနည်းပညာကို အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။စမ်းသပ်ကိရိယာသည် ယေဘူယျအားဖြင့် PE ကုမ္ပဏီမှထုတ်လုပ်သော ABI7100 PCR အပူစက်ဘီးကိုအသုံးပြုပြီး အခြားအပူစက်ဘီးများကိုလည်း အသုံးပြုနိုင်သည်။စမ်းသပ်မှုအတွက် ABI7700 တုံ့ပြန်မှုအမျိုးအစား တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကို အသုံးပြုပါက တုံ့ပြန်မှုပြီးပါက၊ အရေအတွက်ရလဒ်များကို ကွန်ပျူတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် တိုက်ရိုက်ပေးနိုင်ပါသည်။အခြားအပူစက်ဘီးများကို အသုံးပြုပါက၊ RQ+၊ RQ-၊ △RQ တို့ကို တွက်ချက်ရန် တုံ့ပြန်မှုပြွန်ရှိ fluorescence အချက်ပြမှုကို တစ်ပြိုင်နက်တည်းတိုင်းတာရန် fluorescence detector ကို အသုံးပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။RQ+ သည် နမူနာပြွန်၏ ဖြာထွက်မှုအုပ်စု၏ ဖြာထွက်မှုပြင်းထန်မှုအချိုးကို ကိုယ်စားပြုပြီး quenching group ၏ဖြာထွက်တောက်ပမှုပြင်းထန်မှုသို့ RQ- သည် အလွတ်ပြွန်အတွင်းရှိ နှစ်ခု၏အချိုးကိုကိုယ်စားပြုသည်၊ △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) သည် PC အတွင်းရရှိသောအချက်ပြမှုပြောင်းလဲမှုပြီးနောက် ဒေတာပမာဏကို ကိုယ်စားပြုသည်။fluorescent probes များကို မိတ်ဆက်ခြင်းကြောင့်၊ စမ်းသပ်မှု၏ တိကျမှုမှာ သိသိသာသာ တိုးတက်လာပါသည်။probe ဒီဇိုင်းသည် ယေဘူယျအားဖြင့် အောက်ပါအခြေအနေများနှင့် ကိုက်ညီသင့်သည်- ① ချိတ်၏တိကျသေချာစေရန်အတွက် probe ၏အရှည်သည် 20-40 bases ခန့်ဖြစ်သင့်သည်။②Nucleotide တစ်မျိုးတည်း၏ ထပ်ပွားမှုကို ရှောင်ရှားရန် GC ဘေ့စ်များ၏ ပါဝင်မှုသည် 40% နှင့် 60% ကြားဖြစ်သည်။③ ပေါင်းစပ်ပြုလုပ်ခြင်း သို့မဟုတ် primer များနှင့် ထပ်နေခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။④ probe နှင့် template အကြား ချိတ်ဆက်မှု၏ တည်ငြိမ်မှုသည် primer နှင့် template အကြား ချိတ်ဆက်မှု၏ တည်ငြိမ်မှုထက် ပိုကြီးသည်၊ ထို့ကြောင့် probe ၏ Tm တန်ဖိုးသည် primer ၏ Tm တန်ဖိုးထက် အနည်းဆုံး 5°C မြင့်သင့်သည်။ထို့အပြင်၊ probe ၏အာရုံစူးစိုက်မှု၊ probe နှင့် template sequence နှင့် probe နှင့် primer အကြားအကွာအဝေးသည် စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသည်။
ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman ထုတ်လုပ်သူနှင့် တင်သွင်းသူ |Foregene (foreivd.com)
တင်ချိန်- အောက်တိုဘာ ၁၅-၂၀၂၁
