1. RNA ဖြေရှင်းချက်၏ စုပ်ယူမှုကို စစ်ဆေးပါ။
280၊ 320၊ 230 နှင့် 260 nm တွင် စုပ်ယူမှုသည် nucleic acid၊ နောက်ခံ (solution turbidity)၊ ဆားပြင်းအားနှင့် ပရိုတင်းကဲ့သို့သော အော်ဂဲနစ်အရာများ၏ တန်ဖိုးများကို ကိုယ်စားပြုပါသည်။ယေဘုယျအားဖြင့် OD260/OD280 (Ratio, R) ကိုသာကြည့်ပါ။1.8 ~ 2.0 ဖြစ်သောအခါ၊ RNA တွင် ပရိုတင်း သို့မဟုတ် အခြားအော်ဂဲနစ်ဒြပ်စင်များ ညစ်ညမ်းမှုကို ခံနိုင်ရည်ရှိမည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ထင်မြင်သော်လည်း Tris ကို စုပ်ယူမှုကိုသိရှိရန် ကြားခံအဖြစ်အသုံးပြုသည့်အခါ R တန်ဖိုးသည် 2 ထက် ပိုနေနိုင်သည် (ယေဘုယျအားဖြင့် <2.2 ဖြစ်သင့်သည်) ကို သတိပြုသင့်သည်။R<1.8 ဖြစ်သောအခါ၊ ဖြေရှင်းချက်အတွင်းရှိ ပရိုတင်း သို့မဟုတ် အခြားအော်ဂဲနစ်ပစ္စည်းများ၏ ညစ်ညမ်းမှုသည် ပိုမိုထင်ရှားလာပြီး RNA ၏ ကံကြမ္မာကို လိုအပ်ချက်များအရ ဆုံးဖြတ်နိုင်သည်။R> 2.2 ဖြစ်သောအခါ၊ RNA သည် တစ်ခုတည်းသော နူကလိယအက်ဆစ်အဖြစ်သို့ ဟိုက်ဒရောလစ်ဖြစ်သွားသည်ဟု ဆိုလိုသည်။
2. RNA ၏ Electrophoretic ပုံစံ
ယေဘူယျအားဖြင့်၊ denaturing gel ကို RNA electrophoresis အတွက်အသုံးပြုသော်လည်း RNA ၏အရည်အသွေးကိုရှာဖွေရန်အတွက်သာဖြစ်လျှင် denaturing gel မလိုအပ်ဘဲ၊ သာမန် agarose gel ကိုသုံးနိုင်သည်။electrophoresis ၏ ရည်ရွယ်ချက်မှာ 28S နှင့် 18S ကြိုးဝိုင်းများ၏ သမာဓိနှင့် ၎င်းတို့၏ အချိုး သို့မဟုတ် mRNA smear ၏ သမာဓိကို သိရှိရန် ဖြစ်သည်။ယေဘူယျအားဖြင့်၊ 28S နှင့် 18S ကြိုးများသည် တောက်ပ၊ ကြည်လင်ပြီး ပြတ်သားပါက (တီးဝိုင်းများ၏ အစွန်းများကို ရည်ညွှန်းသည်မှာ ရှင်းနေသည်)၊ 28S ၏ တောက်ပမှုသည် 18S တီးဝိုင်းထက် နှစ်ဆပိုများပါက၊ RNA ၏ အရည်အသွေးကို ကောင်းမွန်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။
အထက်ဖော်ပြပါနည်းလမ်းများသည် ကျွန်ုပ်တို့အသုံးများသော နည်းလမ်းနှစ်ခုဖြစ်သော်လည်း၊ ဤနည်းလမ်းနှစ်ခုစလုံးသည် RNA ဖြေရှင်းချက်တွင် ကျန်ရှိသော RNase ရှိမရှိကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း မပြောနိုင်ပါ။ဖြေရှင်းချက်တွင် RNase ပမာဏ အလွန်နည်းပါးပါက၊ ၎င်းကို အထက်ဖော်ပြပါနည်းလမ်းဖြင့် သိရှိရန် ခက်ခဲသော်လည်း၊ နောက်ဆက်တွဲ အင်ဇိုင်းတုံ့ပြန်မှုအများစုသည် ၃၇ ဒီဂရီနှင့် အချိန်ကြာမြင့်စွာ လုပ်ဆောင်ကြသည်။ဤနည်းအားဖြင့် RNA ဖြေရှင်းချက်တွင် RNase ပမာဏ အလွန်နည်းပါးပါက၊ နောက်ဆက်တွဲစမ်းသပ်မှုများတွင် ၎င်းတို့၏အခန်းကဏ္ဍကို ပါဝင်ရန် အလွန်သင့်လျော်သော ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် အချိန်ရှိမည်ဖြစ်ပြီး၊ ဤအချိန်တွင် စမ်းသပ်မှုမှာ အေးခဲသွားမည်ဖြစ်သည်။အောက်တွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် RNA ဖြေရှင်းချက်တွင် ကျန်ရှိသော RNase ရှိမရှိ အတည်ပြုနိုင်သော နည်းလမ်းကို မိတ်ဆက်ပေးပါသည်။
3. အပူထိန်းသိမ်းခြင်းစမ်းသပ်မှု
နမူနာ အာရုံစူးစိုက်မှုအရ၊ RNA ဖြေရှင်းချက်မှ 1000 ng RNA နှစ်ခုကို ဆွဲထုတ်ပြီး 0.5 ml centrifuge tube ထဲသို့ ပေါင်းထည့်ကာ pH 7.0 Tris ကြားခံဖြင့် စုစုပေါင်း 10 ul ပမာဏအထိ ဖြည့်သွင်းပြီးနောက် ပြွန်အဖုံးကို တံဆိပ်ခတ်ပါ။၎င်းတို့ထဲမှ တစ်ခုကို အပူချိန် 70 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် အဆက်မပြတ်ရေချိုးပြီး 1 နာရီကြာ နွေးအောင်ထားပါ။ကျန်တစ်ပိုင်းကို -20°C ရေခဲသေတ္တာထဲတွင် ၁ နာရီကြာ သိမ်းဆည်းထားသည်။အချိန်ပြည့်သောအခါ၊ electrophoresis အတွက် နမူနာနှစ်ခုကို ဖယ်ရှားပါ။electrophoresis ပြီးသောအခါ၊ နှစ်ခု၏ electrophoretic bands များကို နှိုင်းယှဉ်ပါ။၎င်းတို့နှစ်ခု၏ bands များသည် တသမတ်တည်း သို့မဟုတ် သိသာထင်ရှားသော ခြားနားမှုမရှိပါက (ဟုတ်ပါတယ်၊ ၎င်းတို့၏ band များသည် နည်းလမ်း 2 တွင် အခြေအနေများနှင့် ကိုက်ညီသည်)၊ ၎င်းသည် RNA ဖြေရှင်းချက်တွင် ကျန်ရှိသော RNase ညစ်ညမ်းမှုမရှိကြောင်း ဆိုလိုပြီး RNA ၏ အရည်အသွေးသည် အလွန်ကောင်းမွန်ပါသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ 70°C တွင်ပေါက်ထားသောနမူနာသည် သိသိသာသာပြိုကွဲသွားသည်ကိုပြသပါက RNA အဖြေတွင် RNase ညစ်ညမ်းမှုရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
2 RNA ထုတ်ယူမှုအတွက် စမ်းသပ်နည်းများနှင့် နည်းစနစ်များ
RNA ထုတ်ယူသောအခါတွင် ကျွန်ုပ်တို့ကြုံတွေ့ရလေ့ရှိသည့် ပြဿနာများမှာ (၁) RNA အထွက်နှုန်း နည်းပါးခြင်း၊(၂) RNA သည် ပြင်းထန်သော ဆားညစ်ညမ်းမှု၊(၃) RNA သည် ပြင်းထန်သော သြဂဲနစ်ပျော်ဝင်မှု ညစ်ညမ်းမှု၊(၄) နမူနာပြိုကျခြင်းနှင့် အခြားပြဿနာများ
1. အသုံးများသော စုစုပေါင်း RNA ထုတ်ယူသည့် ဓာတ်ပစ္စည်းများ
guanidine isothiocyanate နည်းလမ်းနှင့် Trizol နည်းလမ်းတို့သည် တိရစ္ဆာန်တစ်ရှူးများနှင့် တိရစ္ဆာန်ဆဲလ်များမှ RNA အားလုံးကို ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးအများဆုံးနည်းလမ်းများဖြစ်သည်။ယုန်အရေခွံနှင့် တိရိစ္ဆာန်ဆက်စပ်တစ်ရှူးများမှ စုစုပေါင်း RNA ထုတ်ယူခြင်းကဲ့သို့သော ထုတ်ယူရန် ခက်ခဲသော နမူနာများနှင့် တစ်ရှူးများအတွက် အထူးသင့်လျော်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ Trizol ကို ယေဘူယျရည်ရွယ်ချက် lysis ဓါတ်ပစ္စည်းအဖြစ် အပင်တစ်ရှူးများ၊ ဘက်တီးရီးယားများ၊ မှိုများနှင့် အခြားတစ်ရှူးများကို ထုတ်ယူရန်အတွက်လည်း အသုံးပြုနိုင်သည်။Camellia oleifera၊ လက်ဖက်ရွက်၊ rapeseed အစရှိသည်တို့ ကဲ့သို့သော polysaccharides နှင့် polyphenols ပါဝင်သော အပင်တစ်ရှူးများအတွက် CTAB နည်းလမ်းကို စုစုပေါင်း RNA ထုတ်ယူရန်အတွက်လည်း အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။
သမားရိုးကျနည်းလမ်းတစ်ခုအနေဖြင့်၊ ကော်လံနှစ်ထပ်နည်းလမ်းသည် ၎င်း၏ပုံမှန်အပူချိန်လုပ်ဆောင်မှုကြောင့်လည်း အလွန်ရေပန်းစားပြီး၊ RNase နှင့် ဘေးကင်းမှု- ကလိုရိုဖောင်၊ ဖီနောနှင့် အခြားအော်ဂဲနစ်ဓာတ်များကို ထုတ်ယူရန် မလိုအပ်ပါ။(အကြံပြုထားသောထုတ်ကုန်များ )
2. တိရိစ္ဆာန်တစ်သျှူးများမှ စုစုပေါင်း RNA ထုတ်ယူခြင်း။
(၁) လတ်ဆတ်သောတစ်ရှူးများကို လတ်ဆတ်ခြင်းမရှိပါက (ဖြစ်နိုင်ရင် သုံးလအတွင်း - 80 ℃ ရေခဲသေတ္တာအတွင်း သို့မဟုတ် နိုက်ထရိုဂျင်အရည်တွင် အေးခဲစေပါသည်။ တစ်ရှူးကို ဖြတ်သည့်အခါ အခန်းအပူချိန်တွင် တိုက်ရိုက်မဖြတ်ပါနှင့်၊ ရေခဲသေတ္တာပေါ်တွင် သေချာစွာထည့်ပါ၊ ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲပြီး ရောနှောခြင်းကို ရှောင်ရှားပါ။
(၂) တစ်ရှူးအပိုင်းအစအသေးတစ်ခုကိုဖြတ်ရန် သန့်ရှင်းသောကတ်ကြေးနှင့် ခြစ်တံများကိုအသုံးပြု၍ နမူနာဖြတ်သည့်အခါ တစ်ရှူး၏ဗဟိုကိုဖြတ်ရန်ကြိုးစားပါ၊ သို့မဟုတ် အလယ်မှတစ်ရှုးအပိုင်းကြီးကို ဦးစွာဖြတ်ပါ၊ ထို့နောက်နမူနာကို လတ်ဆတ်သောခွဲစိတ်အနေအထားတွင်ဖြတ်ပါ။ဖယ်ရှားလိုက်သောတစ်ရှူးများကို အပြည့်အ၀ခွဲထားသင့်သည်၊ ဖျက်စီးထားသောတစ်ရှူးများကို RNase မပါဘဲ EP ပြွန်ထဲသို့ထည့်ကာ lysate ကိုထည့်ပါ၊ ဖျက်လိုက်သောတစ်ရှူးများကို lysate နှင့်အပြည့်အဝထိတွေ့သင့်ပြီး တစ်သားတည်းဖြစ်အောင်ပြင်ဆင်ပါ။
(၃) ပုံမှန်တစ်ရှူးများအတွက် မတ်ပဲအရွယ်တစ်ရှူး (30-60 မီလီဂရမ်) ကို တစ်သားတည်းဖြစ်စေရန် ရွေးချယ်ပါ။တစ်ရှူးများတွင် ပရိုတင်း၊ အဆီ သို့မဟုတ် အသည်းကဲ့သို့သော သိပ်သည်းသော အမျှင်တစ်ရှူးများ များပြားနေပါက၊ ဖြတ်ထားသော တစ်ရှူးများ၏ ပမာဏကို သင့်လျော်စွာ တိုး သို့မဟုတ် လျှော့ချပါ (ချန်လှပ်ထားနိုင်သည်) 10~20 mg ကို ရွေးချယ်ပါ။
(၄) ငါးကြွက်သား၊ ပုစွန်အသား၊ ရေခူနှင့် ရေပါဝင်မှုမြင့်မားသော အခြားတစ်ရှူးများကို ထုတ်ယူပါက နမူနာပမာဏကို သင့်လျော်စွာ တိုးမြှင့်သင့်သည် (အကြံပြုထားသည့် 100-200 mg)။
(၅) အခြေအနေများခွင့်ပြုပါက၊ ထိုကဲ့သို့သောပစ္စည်းများမရှိပါက၊ တိရစ္ဆာန်တစ်သျှူးများကို မြင့်မားသောတစ်ရှူး homogenizer ဖြင့် တစ်သားတည်းဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပြီးနောက် တိုက်ရိုက်ထုတ်ယူနိုင်သည်။
(၆) နောက်ဆုံး ထုတ်ယူပြီးနောက် ရရှိသော RNA ကို RNA ၏ ပျက်စီးယိုယွင်းမှုကို လျှော့ချရန်အတွက် ရေခဲသေတ္တာပေါ်တွင် ချက်ချင်း ထားရမည်။
3. တိရစ္ဆာန်ဆဲလ် RNA ထုတ်ယူခြင်း။
(1) Suspension cells- centrifuge ကိုတိုက်ရိုက် centrifuge လုပ်ပြီး ကြားခံကို စွန့်ပစ်ပါ၊ 1-2 ကြိမ် ပိုးသတ်ထားသော PBS ဖြင့် ဆေးပါ၊ ထို့နောက် သင့်လျော်သော PBS ပမာဏဖြင့် ဆိုင်းငံ့ထားကာ lysate အတွက် lysate ထည့်ပါ။အရည်ကိုလုံးဝစွန့်ပစ်ပြီးနောက် lysate ကို မိုးရွာသောဆဲလ်များသို့ တိုက်ရိုက်မထည့်ပါနှင့်။၎င်းသည် အပြင်အလွှာရှိ lysed ဆဲလ်များအပြီးတွင် ထုတ်လွှတ်သော histone package အား မိုးရေခံနေသောဆဲလ်များ၏ အပြင်ဘက်သို့ တွယ်ကပ်စေပြီး၊ ထို့ကြောင့် lysate နှင့် pellet အတွင်းရှိ ဆဲလ်များ၏ အဆက်အသွယ်ကို ကန့်သတ်စေသည်။မပြည့်စုံသောဆဲလ် lysis ကိုဖြစ်ပေါ်စေပြီး RNA အထွက်နှုန်းကိုလျော့ကျစေသည်။
(၂) ကပ်တွယ်နေသော သို့မဟုတ် တင်းတင်းကြပ်ကြပ်မကပ်ထားသော ဆဲလ်များ- ကြားခံကို စွန့်ပစ်ပြီးနောက် PBS ဖြင့် ၁-၂ ကြိမ် ဆေးကြောပြီးနောက် သင့်လျော်သော PBS ပမာဏကို တိုက်ရိုက်စုပ်ယူကာ ဆဲလ်များကို မှုတ်ထုတ်ရန်အတွက် ပိုက်ဆက် သို့မဟုတ် သေနတ်ဖြင့် မှုတ်ထုတ်ကာ ၎င်းတို့အား RNA ကင်းစင်သောဆဲလ်များသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ထုတ်ယူရန်အတွက် အင်ဇိုင်း၏ EP ပြွန်တွင် lysate ကို ထည့်ပါ။
(၃) Adherent ဆဲလ်များ- trypsin ဖြင့် ပထမဦးစွာ ချေဖျက်ရန် လိုအပ်ပြီး၊ ထို့နောက် RNase-free EP ပြွန်များထဲသို့ စုစည်းကာ၊ supernatant များကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် centrifuged၊ ပိုလျှံနေသော trypsin ကိုဖယ်ရှားရန်အတွက် PBS ဖြင့် 1-2 ကြိမ် ဆေးကြောကာ သင့်လျော်သော PBS ပမာဏဖြင့် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီးနောက် ထုတ်ယူသည့်အဆင့်ကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ပါ။
4. Plant RNA ထုတ်ယူခြင်း။
အပင်တစ်ရှူးများတွင် ဖီနိုလစ်ဒြပ်ပေါင်းများ ကြွယ်ဝသည် သို့မဟုတ် polysaccharides ကြွယ်ဝသော သို့မဟုတ် အမျိုးအမည်မသိသော ဆင့်ပွား metabolites အချို့ပါရှိသည်၊ သို့မဟုတ် RNase ၏ လုပ်ဆောင်ချက် မြင့်မားသည်။ဤအရာများကို ဖယ်ရှားရန်ခက်ခဲသော မပျော်ဝင်နိုင်သော ရှုပ်ထွေးမှုများ သို့မဟုတ် ကော်လိုဒိုင်းမိုးရေခဲများအဖြစ် ဆဲလ် lysis ပြီးနောက် RNA နှင့် တင်းကျပ်စွာပေါင်းစပ်ထားသည်။ထို့ကြောင့် အပင်တစ်သျှူးများကို ထုတ်ယူသည့်အခါ အပင်အတွက် အစုံလိုက်ရွေးချယ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။အစုံပါရှိ lysate သည် polyphenols များ အလွယ်တကူ ဓာတ်တိုးခြင်းနှင့် polysaccharide ဒြပ်ပေါင်းများနှင့် nucleic acids တို့ကို ခွဲထုတ်ခြင်းဆိုင်ရာ ပြဿနာများကို ထိရောက်စွာ ဖြေရှင်းပေးနိုင်ပါသည်။
(polysaccharide polyphenol အပင် RNA ထုတ်ယူမှုအတွက်၊ အကြံပြုထားသော ထုတ်ကုန်များ-
(၁) အပင်၏ အခွံ၊ ပျော့ဖတ်၊ အစေ့များ၊ အရွက်များ စသည်တို့ကို ငရုတ်ဆုံတွင် မြေအပြည့်ထည့်ထားရပါမည်။ကြိတ်ခွဲခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း နိုက်ထရိုဂျင်အရည်ကို နိုက်ထရိုဂျင်အရည်ပျော်မှုမဖြစ်စေရန် အချိန်မီ ဖြည့်စွက်သင့်သည်။RNA ပြိုကွဲခြင်းမှရှောင်ရှားရန် မြေနမူနာကို lysate ထဲသို့ အမြန်ထည့်ကာ လှုပ်ခါသင့်သည်။
(၂) ဆန်နှင့် ဂျုံရွက်ကဲ့သို့သော အမျှင်ဓာတ်ကြွယ်ဝသောနမူနာများအတွက်၊ ထုတ်ယူမှုပမာဏကို သင့်လျော်စွာ လျှော့ချသင့်သည်၊ သို့မဟုတ်ပါက တစ်ရှူးများကို ကြိတ်ချေပြီး lysis သည် ပြီးပြည့်စုံမည်မဟုတ်သောကြောင့် ထုတ်ယူထားသော RNA ၏ အထွက်နှုန်းနည်းပါသည်။
(၃) သလဲသီး၊ ဖရဲသီး၊ မက်မွန်သီး စသည်တို့ကဲ့သို့ ရေဓာတ်မြင့်မားသော အပင်တစ်ရှူးများအတွက် နမူနာအရွယ်အစားကို သင့်လျော်စွာ တိုးမြှင့်သင့်သည် (100-200 mg သည် စိတ်ကြိုက်ရွေးချယ်နိုင်သည်)။
(၄) အပင်အရွက်များ၊ အမြစ်များ၊ မာကျောသောအသီးများနှင့် အခြားပစ္စည်းများကဲ့သို့သော အပင်တစ်ရှူးများကို ငရုတ်ဆုံတစ်ခုထဲတွင် ပါဝင်ပစ္စည်းများ သေချာစွာကြိတ်ချေရန် နိုက်ထရိုဂျင်အရည်ကို အသုံးပြုရန် ယေဘုယျအားဖြင့် အကြံပြုထားပြီး ထုတ်ယူသည့်အဆင့်ကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ပါ။သမားရိုးကျ တစ်ရှူးများကို တူညီအောင်ပြုလုပ်ခြင်းများသည် အပင်တစ်သျှူးများကို တူညီအောင်ပြုလုပ်ရာတွင် ထိရောက်မှု မရှိနိုင်သော်လည်း ယေဘုယျအားဖြင့် အကြံပြုထားခြင်းမရှိပါ။
5. RNA ထုတ်ယူမှုအတွက် ကြိုတင်ကာကွယ်မှုများ
(၁) ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲပြီး အရည်ပျော်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် တစ်ရှူးနမူနာများကို တတ်နိုင်သမျှ လတ်ဆတ်နေသင့်သည်။
(၂) တစ်သျှူးကို ထုတ်ယူစဉ်အတွင်း အပြည့်အဝ မြေသားထားသင့်ပြီး တစ်သျှူးပမာဏသည် အလွန်အမင်း မနည်းသင့်ပါ။
(၃) နမူနာကို အပြည့်အဝ lyse လုပ်ရန် lysate ပေါင်းထည့်ပြီးနောက် လုံလောက်သော ပေါက်ဖွားချိန်ကို ပေးသင့်သည်။
(4) ထုတ်ယူရန်အတွက် Trizol နည်းလမ်းကိုအသုံးပြုသည့်အခါ၊ stratification ပြီးနောက် supernatant ကိုစုပ်ယူခြင်းနိယာမမှာ "ရှူသွင်းသည်ထက်နည်းသောအသက်ရှူခြင်းကိုနှစ်သက်သည်" ဖြစ်ကာ အလယ်အလွှာသို့မထုတ်ယူရဘဲ၊ သို့မဟုတ်ပါက ၎င်းသည် ပြင်းထန်သောမျိုးဗီဇ DNA ညစ်ညမ်းမှုကိုဖြစ်စေသည်။
(၅) ဆေးကြောသည့်အခါတွင် ဆေးရည်သည် ပြွန်နံရံတစ်ဝိုက်တွင် အပြည့်စိမ့်ဝင်နေသင့်သည်။
(၆) ကော်လံထုတ်ယူသည့်နည်းလမ်းအတွက်၊ ဆေးကြောပြီးနောက် ကော်လံကို ဖယ်ထုတ်ခြင်းအပြင်၊ စုပ်ယူမှုကော်လံကို အလွန်သန့်ရှင်းသော ခုံတန်းလျားတစ်ခုတွင် ထားရှိကာ အော်ဂဲနစ်အမှုန်အမွှားများကို ခြောက်သွေ့သွားစေရန် ၅-၁၀ မိနစ်ခန့် နှပ်ထားသင့်သည်။
(၇) ကော်လံနည်းလမ်း၏ နောက်ဆုံး elution တွင် DEPC ရေထည့်ပြီးနောက်၊ ၎င်းကို ၃-၅ မိနစ်ခန့် ပျိုးထောင်ပေးသင့်သည်၊ သို့မဟုတ် အထွက်နှုန်းတိုးစေရန် DEPC ရေကို 60°C သို့ ကြိုတင်အပူပေးသင့်သည်။ရိုးရာ Trizol cleavage နှင့် isopropanol မိုးရွာသွန်းမှုနည်းလမ်းတွင်၊ နောက်ဆုံး RNA သည် DEPC ရေတွင် ပျော်သွားသည်၊ ထို့ကြောင့် ပျော်ဝင်ရန်အတွက် သင့်လျော်သောအချိန်တစ်ခုပေးသင့်ပြီး centrifuge tube ၏အောက်ခြေကို pipette ထိပ်ဖျားဖြင့် ဆက်တိုက် မှုတ်ထုတ်သင့်သည်။
3 Three RNA အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းခြင်း/ အရည်အသွေးညံ့ခြင်းအတွက် အကြောင်းရင်းများနှင့် ဖြေရှင်းချက်များ
1. အထွက်နှုန်းနည်းလွန်းတယ်။
ထုတ်ယူထားသောနမူနာသည် နည်းလွန်းသည်၊ စုစုပေါင်းပမာဏ မလုံလောက်ပါ သို့မဟုတ် ထုတ်ယူထားသောနမူနာသည် အလွန်အကျွံဖြစ်ပြီး lysis မပြီးမြောက်ပါ။ထုတ်ယူရန်အတွက် သင့်လျော်သော အရည်အသွေးရှိသော တစ်ရှူး သို့မဟုတ် ဆဲလ်များကို အသုံးပြုသင့်သည်၊ နမူနာ၏ကြိုတင်ကုသမှုကို ကောင်းမွန်စွာလုပ်ဆောင်ရမည်ဖြစ်ပြီး lysis သည် လုံလောက်သင့်သည်။
2. Genome အကြွင်းအကျန်များ
Trizol နည်းလမ်းဖြင့် ထုတ်ယူသောအခါ၊ အပေါ်ယံအလွှာကို အလယ်အလွှာသို့ စုပ်ယူလိုက်သောအခါ၊ ပြင်းထန်သော ဂျီနိုမ်ညစ်ညမ်းမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေလိမ့်မည်။အလယ်အလွှာသို့ မစို့စေရန် အလွှာလိုက်သောအခါ အထူးသတိထားသင့်သည်။ကော်လံနည်းလမ်းကို ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးပြုပါက၊ ထုတ်ယူရန်အတွက် DNase I ပါရှိသော အစုံကို ရွေးချယ်နိုင်ပါသည်။အမြှေးပါးပေါ်ရှိ nucleic acid သည် DNA အကြွင်းအကျန်များကို များစွာလျှော့ချပေးနိုင်သော DNase I ဖြင့် တိုက်ရိုက်ချေဖျက်သည်။
3. RNA ပျက်စီးခြင်း။
၎င်းသည် ထုတ်ယူထားသောနမူနာကိုယ်တိုင်၏ ပျက်စီးယိုယွင်းခြင်း သို့မဟုတ် ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း ဖြစ်ပေါ်လာသော ပျက်စီးယိုယွင်းခြင်းဖြစ်နိုင်သည်။တတ်နိုင်သမျှ လတ်ဆတ်သောနမူနာများကို RNA ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးပြုသင့်ပြီး စုဆောင်းထားသောနမူနာများကို နိုက်ထရိုဂျင်အရည် သို့မဟုတ် -80°C ရေခဲသေတ္တာတွင် အချိန်မီသိမ်းဆည်းထားသင့်ပြီး ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲခြင်းနှင့် အရည်ပျော်ခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ရပါမည်။RNase/DNase အခမဲ့အကြံပြုချက်များ၊ centrifuge ပြွန်များနှင့် အခြားပစ္စည်းများကို RNA ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တွင် အသုံးပြုသင့်သည်။ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်သည် မြန်နိုင်သမျှ မြန်သင့်သည်။ထုတ်ယူထားသော RNA ကို ရေခဲသေတ္တာတစ်ခုပေါ်တွင် ထားရှိကာ -80 တွင် အချိန်မီသိမ်းဆည်းထားသင့်သည်။ထုတ်ယူထားသော RNA ကို gel electrophoresis ဖြင့်တွေ့ရှိရန်လိုအပ်ပါက၊ electrophoresis ကိုထုတ်ယူပြီးနောက်ချက်ချင်းလုပ်ဆောင်သင့်ပြီး electrophoresis ကြားခံအား အသစ်ပြင်ဆင်ထားသောတစ်ခုနှင့်အစားထိုးသင့်သည်။
4. ဆား နှင့် အော်ဂဲနစ် ပျော်ရည် အကြွင်းအကျန်များ
ထုတ်ယူသည့် ဓာတုပစ္စည်းများတွင် ဖီနောနှင့် ဂူနီဒင်းဆားများ ပါဝင်ပြီး ရေဆေးရည်တွင် အီသနောပါရှိသည်။ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ lysate သည် လုံးဝစုပ်ယူပြီး စွန့်ပစ်ခြင်းမခံရဘဲ၊ ရေဆေးရည်သည် အပြည့်အဝခြောက်သွေ့ခြင်းမရှိပါ။ကျန်ရှိသောဆားများနှင့် အော်ဂဲနစ်ပျော်ရည်များသည် နောက်ဆက်တွဲ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းနှင့် PCR အတွက် အန္တရာယ်ဖြစ်စေသည်။တားဆီးခြင်း၏ဒီဂရီအမျိုးမျိုး၊ ထို့ကြောင့်ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်းတစ်ရှူး lysate ကိုအပြည့်အဝဖယ်ရှားသင့်သည်၊ သို့မှသာပြွန်၏ပတ် ၀ န်းကျင်နံရံများကိုဆေးကြောရန်လုံလောက်သောဆေးကြောသင့်သည်။ထို့အပြင်၊ ပြွန်ကို ရှင်းထုတ်ပြီး လွင့်သွားခြင်းသည် အော်ဂဲနစ်ဒြပ်အကြွင်းအကျန်များကို ပိုမိုလျှော့ချပေးမည့် လိုအပ်သောအဆင့်တစ်ခုဖြစ်သည်။
RNA ထုတ်ယူခြင်းဆိုင်ရာ အချက်အလက်များ ပိုမိုသိရှိလိုပါက ကျွန်ုပ်တို့၏ ၀က်ဘ်ဆိုဒ်တွင် ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုပါ။
ပိုမိုသိရှိလိုပါကများအတွက် www.foreivd.com ။
စာတင်ချိန်- ဒီဇင်ဘာ-၀၁-၂၀၂၂
