PCR သည် နျူကလိယအက်ဆစ် ချဲ့ထွင်မှုနည်းပညာကို အသုံးအများဆုံးဖြစ်ပြီး ၎င်း၏ အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် တိကျမှုတို့ကြောင့် တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုပါသည်။သို့ရာတွင်၊ PCR သည် ထပ်ခါတလဲလဲ အပူလွန်ကဲမှု လိုအပ်ပြီး ဆေးဘက်ဆိုင်ရာ နယ်ပယ်စမ်းသပ်မှုတွင် ၎င်း၏အသုံးချမှုကို ကန့်သတ်ထားသည့် တူရိယာများနှင့် စက်ပစ္စည်းများအပေါ် မှီခိုခြင်း၏ ကန့်သတ်ချက်များကို မဖယ်ရှားနိုင်ပါ။

၁၉၉၀ ပြည့်လွန်နှစ်များအစောပိုင်းမှစ၍၊ ဓာတ်ခွဲခန်းအများအပြားသည် အပူဒဏ်ခံခြင်းမလိုအပ်သော အဆက်မပြတ် အပူချိန်ချဲ့ထွင်ခြင်းနည်းပညာကို စတင်တီထွင်ခဲ့ကြသည်။ယခုအခါ ၎င်းတို့သည် loop-mediated isothermal amplification technology၊ strand replacement isothermal amplification technology၊ rolling circle isothermal amplification technology နှင့် nucleic acid sequence မှီခိုမှုကို တီထွင်ခဲ့သည်။Isothermal amplification နည်းပညာနှင့် အခြားနည်းပညာများ။ 

Loop-mediated isothermal amplification

ချဲ့ထွင်ခြင်းနိယာမသည် DNA သည် 65°C ခန့်တွင် ဒိုင်းနမစ်မျှခြေအခြေအနေတွင် ရှိနေသည်ဟူသောအချက်အပေါ် အခြေခံထားသည်။primer တစ်ခုခုကို base-paired လုပ်ပြီး double-stranded DNA ရဲ့ ပါ၀င်တဲ့ အစိတ်အပိုင်းကို ဖြန့်လိုက်တဲ့အခါ၊ အခြားကြိုးက ကွဲသွားပြီး single-stranded ဖြစ်သွားပါလိမ့်မယ်။

ဤအပူချိန်တွင် DNA သည် ကြိုးမျှင်-ရွှေ့ပြောင်းခြင်း DNA ကို စဉ်ဆက်မပြတ် ပျံ့နှံ့စေရန်အတွက် ကြိုးမျှင်-ရွှေ့ပြောင်းခြင်း DNA polymerase ကို အားကိုးရန် သီးခြား primers 4 ခုကို အသုံးပြုသည်။

ပထမဦးစွာ သတ်မှတ်ထားသော မျိုးရိုးဗီဇတွင် F3၊ F2၊ F1၊ B1၊ B2၊ B3 တွင် သီးခြားဒေသ 6 ခုကို ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက် အဆိုပါ သီးခြားဒေသ 6 ခုကို အခြေခံ၍ primers 4 ခု (အောက်ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း)

ရှေ့သွားအတွင်းခံ primer (FIP) သည် F1c နှင့် F2 တို့ဖြစ်သည်။

Backward အတွင်း primer (BIP) ကို B1c နှင့် B2 ဖြင့်ဖွဲ့စည်းထားပြီး TTTT ကို အလယ်တွင် spacer အဖြစ်အသုံးပြုသည်။

ပြင်ပ primers F3 နှင့် B3 တို့သည် ပစ်မှတ်ဗီဇတွင် F3 နှင့် B3 နယ်မြေများ အသီးသီးဖွဲ့စည်းထားသည်။

LAMP တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင်၊ အတွင်း primer ၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည် ပြင်ပ primer ထက် အဆများစွာရှိသည်။အတွင်းပိုင်း primer သည် DNA နှစ်ထပ်ကြိုးမျှင်ကို ဖန်တီးရန်အတွက် ဖြည့်စွက်ကြိုးမျှင်ကို ပုံစံပလိတ်ကြိုးနှင့် ပထမဆုံးပေါင်းစပ်ထားသည်။နောက်ပိုင်းတွင်၊ အပြင်ဘက် primer သည် DNA နှစ်ထပ်ကြိုးကို ပုံစံပလိတ်ကြိုးဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။BstDNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်မှုအောက်တွင်၊ အတွင်းပိုင်း primer ဖြင့်ပေါင်းစပ်ထားသော ပေါင်းစပ်ကြိုးကို ထုတ်လွှတ်သည်။ဆက်တိုက်တုံ့ပြန်မှုများပြီးနောက်၊ ဖြည့်စွက်ကြိုးမျှင်သည် နောက်ဆုံးတွင် နလပိန်တုံးပုံစံဖြင့် DNA ကြိုးမျှင်တစ်ခုတည်းကို ဖွဲ့စည်းသည်။

နလပိန်းတုံးဖွဲ့စည်းပုံ DNA ကို ကြိုးမျှင်တစ်ခုတည်းကိုယ်တိုင်က အကူးအပြောင်း ပင်မကွင်းဆက်တည်ဆောက်ပုံ DNA ကို အဆက်မပြတ်ဖွဲ့စည်းရန် ပုံစံပလိတ်အဖြစ် အသုံးပြုပါသည်။အတွင်းပိုင်းနှင့် အပြင်ဘက် primers များသည် transitional stem-loop တည်ဆောက်ပုံ DNA ကို strand displacement နှင့် extension reactions များကို စဉ်ဆက်မပြတ် လုပ်ဆောင်ပေးကာ နောက်ဆုံးတွင် မတူညီသော အလျားများဖြင့် stem-loop တည်ဆောက်ပုံများစွာကို ဖန်တီးပေးပါသည်။DNA အရောအနှော။

loop-mediated isothermal amplification ၏ အားသာချက်များနှင့် အားနည်းချက်များ

LAMP ၏ အားသာချက်များ

(1) မြင့်မားသော ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်သည် 1 နာရီအတွင်း ပစ်မှတ် ဗီဇ၏ 1-10 ကော်ပီကို ထိထိရောက်ရောက် ချဲ့ထွင်နိုင်ပြီး ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်သည် သာမန် PCR ထက် အဆ 10-100 ဖြစ်သည်။

(၂) တုံ့ပြန်မှုအချိန်တိုတို၊ တိကျမှုအားကောင်းပြီး အထူးကိရိယာများမလိုအပ်ပါ။

မီးခွက်၏ချို့ယွင်းချက်များ-

(၁) Primer ၏ လိုအပ်ချက်များသည် အထူးမြင့်မားသည်။

(၂) ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်ကို ပုံတူပွားခြင်းနှင့် စီခြင်းအတွက် အသုံးမပြုနိုင်သော်လည်း တရားစီရင်ရန်အတွက်သာ အသုံးပြုနိုင်သည်။

(၃) ၎င်း၏ပြင်းထန်သော အာရုံခံနိုင်စွမ်းကြောင့်၊ ၎င်းသည် aerosols များဖွဲ့စည်းရန်လွယ်ကူပြီး မှားယွင်းသောအပြုသဘောများကိုဖြစ်ပေါ်စေပြီး စမ်းသပ်မှုရလဒ်များကို ထိခိုက်စေပါသည်။

Strand displacement amplification

Strand displacement amplification (SDA) သည် 1992 ခုနှစ်တွင် အမေရိကန်ပညာရှင် Walker မှ ပထမဆုံးအဆိုပြုခဲ့သော အင်ဇိုင်းတုံ့ပြန်မှုအပေါ်အခြေခံ၍ ဗီတိုအပူရှိ DNA ချဲ့ထွင်မှုနည်းပညာတစ်ခုဖြစ်သည်။

SDA ၏ အခြေခံစနစ်တွင် ကန့်သတ် endonuclease၊ ကြိုးမျှင်ရွှေ့ပြောင်းခြင်းဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ပါရှိသော DNA polymerase၊ primers အတွဲနှစ်စုံ၊ dNTPs နှင့် calcium နှင့် magnesium ions နှင့် ကြားခံစနစ်များ ပါဝင်သည်။

strand displacement amplification ၏ နိယာမသည် ပစ်မှတ် DNA ၏ အစွန်းနှစ်ဖက်ရှိ ဓာတုဗေဒနည်းအရ ကန့်သတ်ထားသော endonuclease အသိအမှတ်ပြုမှု အစီအစဉ်အပေါ် အခြေခံသည်။endonuclease သည် ၎င်း၏ အသိအမှတ်ပြု site တွင် strand DNA ကွာဟချက်ကို ဖွင့်ပေးပြီး DNA polymerase သည် ကွာဟချက် 3′ End ကို တိုးချဲ့ပြီး နောက် DNA ကြိုးကို အစားထိုးသည်။

အစားထိုးထားသော DNA တစ်ခုတည်းကို primers များနှင့် ပေါင်းစပ်နိုင်ပြီး DNA polymerase ဖြင့် နှစ်ဆအဖြစ် တိုးချဲ့နိုင်သည်။ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို စဉ်ဆက်မပြတ် ထပ်ခါတလဲလဲ ပြုလုပ်နေသောကြောင့် ပစ်မှတ် sequence ကို ထိထိရောက်ရောက် ချဲ့ထွင်နိုင်မည်ဖြစ်သည်။

strand displacement amplification နည်းပညာ၏ အားသာချက်များနှင့် အားနည်းချက်များ

SDA ၏ အားသာချက်များ

ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှု မြင့်မားသည်၊ တုံ့ပြန်မှု အချိန် တိုတောင်းသည်၊ တိကျမှု အားကောင်းသည်၊ အထူး ကိရိယာ မလိုအပ်ပါ။

SDA ၏ ချို့ယွင်းချက်များ-

ထုတ်ကုန်များသည် တစ်ပြေးညီမဟုတ်သောကြောင့် အချို့သောသောင်တင်ခြင်း နှင့် နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော ထုတ်ကုန်များသည် SDA လည်ပတ်မှုတွင် အမြဲထုတ်လုပ်နေပြီး electrophoresis မှတွေ့ရှိသောအခါ အမြီးများမလွဲမသွေဖြစ်ပေါ်လိမ့်မည်။

Rolling စက်ဝိုင်းချဲ့ခြင်း။

Rolling Circle Amplification (RCA) ကို စက်ဝိုင်းဖြင့် လှည့်ပတ်ခြင်းဖြင့် ရောဂါဖြစ်စေနိုင်သော သက်ရှိများထံမှ DNA ကူးယူခြင်းနည်းလမ်းကို ရေးဆွဲခြင်းဖြင့် အဆိုပြုပါသည်။၎င်းသည် အဆက်မပြတ် အပူချိန်တွင် နမူနာပုံစံတစ်ခုအနေဖြင့် ကြိုးတစ်ချောင်းတည်းရှိသော စက်ဝိုင်း DNA ကို အသုံးပြုခြင်းနှင့် ပစ်မှတ်ဗီဇကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် စက်ဝိုင်းပုံစံ DNA ပေါင်းစပ်မှုလုပ်ဆောင်မှုအောက်တွင် အထူး DNA polymerase (Phi29 ကဲ့သို့) ) ကို ရည်ညွှန်းသည်။

RCA ကို linear amplification နှင့် exponential amplification ဟူ၍ ခွဲခြားနိုင်သည်။linear RCA ၏ထိရောက်မှုသည် 10 သို့ရောက်ရှိနိုင်သည်။⁵ကြိမ်၊ နှင့် exponential RCA ၏ထိရောက်မှုသည် 10 သို့ရောက်ရှိနိုင်သည်။⁹ကြိမ်။

ရိုးရှင်းသောခြားနားချက်၊ အောက်ဖော်ပြပါပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း linear amplification a သည် primer 1 ခုသာအသုံးပြုသည်၊ exponential amplification b တွင် primer 2 ခုရှိသည်။

Linear RCA ကို single primer RCA လို့လည်း ခေါ်ပါတယ်။primer သည် စက်ဝိုင်းရှိ DNA နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး DNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်ချက်ဖြင့် တိုးချဲ့သည်။ထုတ်ကုန်သည် ကွင်းဆက်တစ်ခု၏အရှည်ထက် အဆပေါင်း ထောင်ချီသော ထပ်တလဲလဲ အစီအမံများပါရှိသော linear single strand တစ်ခုဖြစ်သည်။

linear RCA ၏ထုတ်ကုန်သည် start primer နှင့်အမြဲချိတ်ဆက်နေသောကြောင့် signal ကိုအလွယ်တကူ fixation သည်အဓိကအားသာချက်ဖြစ်သည်။

Exponential RCA သည် Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA) ဟုလည်းသိကြသော exponential RCA တွင်၊ primer တစ်ခုသည် RCA ထုတ်ကုန်ကို ချဲ့ထွင်ပေးသည်၊ ဒုတိယ primer သည် RCA ထုတ်ကုန်နှင့် ပေါင်းစပ်ပြီး တိုးချဲ့ကာ၊ အစားထိုးမှုသည် RCA ထုတ်ကုန်တွင် ချည်နှောင်ထားပြီးသားဖြစ်သည် downstream primers သည် strand ကို တိုးချဲ့သည်၊ ထုတ်ကုန်တိုးချဲ့ခြင်းနှင့် ထပ်တလဲလဲထုတ်လုပ်ရန် RCA

nucleic acid ချဲ့ထွင်ခြင်း၏ အားသာချက်များနှင့် အားနည်းချက်များ

RCA ၏ အားသာချက်များ

မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်း၊ ကောင်းမွန်သောတိကျမှုနှင့် လည်ပတ်ရလွယ်ကူသည်။

RCA ၏ ချို့ယွင်းချက်များ-

အချက်ပြထောက်လှမ်းမှုအတွင်း နောက်ခံပြဿနာများ။RCA တုံ့ပြန်မှုအတွင်း၊ လည်ပတ်မထားသောသော့ခလောက်နှင့် ပလိတ်မပါသော စုံစမ်းစစ်ဆေးမှု၏ DNA သို့မဟုတ် RNA သည် နောက်ခံအချက်ပြမှုအချို့ကို ထုတ်ပေးနိုင်သည်။ 

Nucleicacid ဆင့်ပွား-အခြေခံချဲ့ထွင်ခြင်း။

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) သည် PCR ကို အခြေခံ၍ တီထွင်ထားသော နည်းပညာအသစ်တစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်းသည် T7 ပရိုမိုးရှင်းအစီအစဉ်ဖြင့် primers တစ်စုံမှ လမ်းညွှန်ထားသည့် စဉ်ဆက်မပြတ်နှင့် isothermal nucleic acid ချဲ့ထွင်မှုဖြစ်သည်။နည်းပညာသည် သမားရိုးကျ PCR နည်းလမ်းထက် အဆ 1000 ပိုများပြီး အထူးကိရိယာများ မလိုအပ်ဘဲ 2 နာရီအတွင်း 109 ကြိမ်ခန့် ဖြင့် ပုံစံပလိတ် RNA ကို ချဲ့ထွင်နိုင်သည်။

ဤနည်းပညာကို ပေါ်လာသည်နှင့်တပြိုင်နက် ရောဂါများကို လျင်မြန်စွာ ရှာဖွေဖော်ထုတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုထားပြီး ကုမ္ပဏီများစွာသည် RNA ထောက်လှမ်းမှုကိရိယာများတွင် ဤနည်းလမ်းကို လက်ရှိအသုံးပြုနေပါသည်။

RNA amplification သည် reverse transcription PCR နည်းပညာကိုလည်း သုံးနိုင်သော်လည်း NASBA တွင် ၎င်း၏ကိုယ်ပိုင်အားသာချက်များရှိသည်- ၎င်းသည် အပူချိန်အဆက်မပြတ်အခြေအနေအောက်တွင် လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး ၎င်းသည် သမားရိုးကျ PCR နည်းပညာထက် ပိုမိုတည်ငြိမ်ပြီး တိကျသည်။

တုံ့ပြန်မှုသည် 41 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင်ရှိပြီး အပြီးသတ်ရန်အတွက် AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase နှင့် primers တစ်စုံ လိုအပ်ပါသည်။

လုပ်ငန်းစဉ်တွင် အဓိကအားဖြင့်-

ရှေ့သွား primer တွင် T7 ပရိုမိုးရှင်း၏ ဖြည့်စွက်အစီအစဥ် ပါရှိသည်။တုံ့ပြန်မှုအတွင်း၊ ရှေ့သို့ primer သည် RNA ကြိုးနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး DNA-RNA နှစ်ထပ်ကြိုးကို ဖန်တီးရန် AMV အင်ဇိုင်းဖြင့် ဓာတ်ပြုသည်။

RNase H သည် RNA ကို ပေါင်းစပ်ကြိုးနှစ်ကြိုးဖြင့် ချေဖျက်ပြီး single-stranded DNA ကို ထိန်းသိမ်းသည်။

ပြောင်းပြန် primer နှင့် AMV အင်ဇိုင်းတို့၏ လုပ်ဆောင်မှုအောက်တွင် T7 ပရိုမိုးရှင်းအစီအစဉ်ပါရှိသော DNA နှစ်ထပ်ကြိုးကို ဖွဲ့စည်းသည်။

T7 RNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်မှုအောက်တွင်၊ ကူးယူဖော်ပြခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ပြီးဆုံးပြီး ပစ်မှတ် RNA ပမာဏများစွာကို ထုတ်လုပ်ပါသည်။

NASBA ၏ အားသာချက်များ

(1) ၎င်း၏ primer တွင် T7 ပရိုမိုးရှင်းအစီအစဥ်ပါရှိသည်၊ သို့သော် နိုင်ငံခြားနှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA တွင် T7 ပရိုမိုးရှင်းအစီအစဥ်မရှိသဖြင့် ချဲ့၍မရနိုင်သောကြောင့် ဤနည်းပညာသည် မြင့်မားသောတိကျမှုနှင့် အာရုံခံနိုင်စွမ်းရှိသည်။

(2) NASBA သည် ပြောင်းပြန် ကူးယူခြင်း လုပ်ငန်းစဉ်ကို ချဲ့ထွင်မှု တုံ့ပြန်မှုတွင် တိုက်ရိုက် ပေါင်းစပ်ပြီး တုံ့ပြန်မှု အချိန်ကို တိုစေပါသည်။

NASBA ၏အားနည်းချက်များ

(၁) တုံ့ပြန်မှု အစိတ်အပိုင်းများသည် ပိုမိုရှုပ်ထွေးသည်။

(၂) တုံ့ပြန်မှုကုန်ကျစရိတ်မြင့်မားစေရန် အင်ဇိုင်းသုံးမျိုးလိုအပ်သည်။