စတင်ပစ္စည်း- RNA

Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) သည် RNA ကို စတင်ပစ္စည်းအဖြစ် အသုံးပြု၍ PCR စမ်းသပ်မှုများတွင် အသုံးပြုသည့် စမ်းသပ်နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ဤနည်းလမ်းတွင် စုစုပေါင်း RNA သို့မဟုတ် messenger RNA (mRNA) ကို reverse transcriptase ဖြင့် ဖြည့်စွက် DNA (cDNA) သို့ ကူးယူဖော်ပြပါသည်။နောက်ပိုင်းတွင်၊ qPCR တုံ့ပြန်မှုကို ပုံစံပလိတ်အဖြစ် cDNA ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။RT-qPCR ကို မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ RNA စွက်ဖက်မှုအတည်ပြုချက်၊ microarray validation၊ ရောဂါပိုးရှာဖွေတွေ့ရှိမှု၊ မျိုးရိုးဗီဇစမ်းသပ်မှုနှင့်ရောဂါသုတေသနအပါအ ၀ င်မော်လီကျူးဇီဝဗေဒအသုံးချမှုအမျိုးမျိုးတွင်အသုံးပြုခဲ့သည်။

RT-qPCR အတွက် အဆင့်တစ်ဆင့်နှင့် နှစ်ဆင့်နည်းလမ်းများ

RT-qPCR ကို အဆင့်တစ်ဆင့် သို့မဟုတ် နှစ်ဆင့်နည်းလမ်းဖြင့် ပြီးမြောက်နိုင်သည်။အဆင့်တစ်ဆင့် RT-qPCR သည် ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြခြင်းနှင့် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းတို့ကို ပေါင်းစပ်ပြီး တူညီသောကြားခံအခြေအနေများအောက်တွင် တူညီသောပြွန်အတွင်း တုံ့ပြန်မှုကို ပြီးမြောက်စေရန် ပြောင်းပြန် transcriptase နှင့် DNA polymerase ကိုခွင့်ပြုသည်။အဆင့်တစ်ဆင့် RT-qPCR သည် sequence-specific primer များကိုသာ အသုံးပြုရန် လိုအပ်သည်။အဆင့်နှစ်ဆင့် RT-qPCR တွင်၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြခြင်းနှင့် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းတို့ကို မတူညီသော ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ထားသော ကြားခံများ၊ တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများနှင့် primer ဒီဇိုင်းဗျူဟာများကို အသုံးပြုကာ ပြွန်နှစ်ခုတွင် လုပ်ဆောင်ပါသည်။

ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-

RT-qPCR အလွယ်ᵀᴹ (တစ်လှမ်း)-SYBR Green I

RT-qPCR အလွယ်ᵀᴹ (ခြေတစ်လှမ်း)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix for First-Strand CDNA Synthesis

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR Easyᵀᴹ-Taqman

စုစုပေါင်း RNA နှင့် mRNA ရွေးချယ်မှု

RT-qPCR စမ်းသပ်မှုတစ်ခုကို ဒီဇိုင်းရေးဆွဲသည့်အခါ၊ စုစုပေါင်း RNA သို့မဟုတ် သန့်စင်ထားသော mRNA ကို ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းအတွက် ပုံစံပလိတ်အဖြစ် အသုံးပြုရန် ဆုံးဖြတ်ရန် အရေးကြီးပါသည်။mRNA သည် အနည်းငယ်ပိုမိုမြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို ပေးစွမ်းနိုင်သော်လည်း စုစုပေါင်း RNA ကို မကြာခဏအသုံးပြုနေဆဲဖြစ်သည်။ယင်းအတွက် အကြောင်းရင်းမှာ စုစုပေါင်း RNA သည် mRNA ထက် အစပြုပစ္စည်းတစ်ခုအဖြစ် ပိုအရေးကြီးသော အားသာချက်ရှိသည်။ပထမဦးစွာ၊ လုပ်ငန်းစဉ်သည် သေးငယ်သော သန့်စင်မှုအဆင့်များ လိုအပ်သည်၊ ၎င်းသည် နမူနာပုံစံ၏ အရေအတွက်ကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ ပြန်လည်ရယူပြီး ဆဲလ်နံပါတ်များစတင်ခြင်းအထိ ရလဒ်များကို ပုံမှန်ဖြစ်စေရန် သေချာစေသည်။ဒုတိယ၊ ၎င်းသည် မတူညီသော mRNAs များ၏ ပြန်လည်ရယူမှုကြောင့် ကွဲလွဲသောရလဒ်များ ဖြစ်နိုင်ခြေကို ရှောင်ရှားနိုင်သည့် mRNA ကြွယ်ဝမှုအဆင့်ကို ရှောင်ရှားသည်။ခြုံငုံအားဖြင့်၊ အပလီကေးရှင်းအများစုတွင် ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ နှိုင်းရအရေအတွက်သည် ထောက်လှမ်းခြင်း၏ အကြွင်းမဲ့ အာရုံခံနိုင်စွမ်းထက် ပိုအရေးကြီးသောကြောင့်၊ စုစုပေါင်း RNA သည် ကိစ္စအများစုတွင် ပို၍သင့်လျော်ပါသည်။

ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း

အဆင့်နှစ်ဆင့်နည်းလမ်းတွင်၊ cDNA တုံ့ပြန်မှုကို ချုပ်ရန် မတူညီသောနည်းလမ်းသုံးမျိုးကို အသုံးပြုနိုင်သည်။ပုံမှန်အားဖြင့် oligo(dT) primers နှင့် random primers တို့ကို ပေါင်းစပ်အသုံးပြုသည်။ဤ primers များသည် mRNA ကြိုးမျှင်ပုံစံပုံစံသို့ ချိတ်ဆက်ပြီး ပေါင်းစပ်မှုအတွက် အစမှတ်ဖြင့် ပြောင်းပြန် transcriptase ကို ပေးပါသည်။

ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း

Reverse transcriptase သည် DNA ကိုပေါင်းစပ်ရန် RNA ကိုအသုံးပြုသောအင်ဇိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည်။အချို့သော ပြောင်းပြန်စာသားမှတ်တမ်းများတွင် RNase လုပ်ဆောင်ချက်ပါရှိပြီး စာသားမှတ်တမ်းပြီးနောက် RNA-DNA ပေါင်းစပ်ကြိုးများတွင် RNA ကြိုးများကို ကျဆင်းစေနိုင်သည်။၎င်းတွင် RNase enzymatic လုပ်ဆောင်ချက်မရှိပါက၊ ပိုမိုမြင့်မားသော qPCR စွမ်းဆောင်ရည်အတွက် RNaseH ကို ထပ်ထည့်နိုင်သည်။အသုံးများသော အင်ဇိုင်းများတွင် Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase နှင့် avian myeloblastoma virus reverse transcriptase တို့ ပါဝင်သည်။RT-qPCR အတွက်၊ ပိုမိုမြင့်မားသော အပူချိန်ထိန်းနိုင်သော ပြောင်းပြန် transcriptase ကို ရွေးချယ်ရန် သင့်လျော်သည်၊ သို့မှသာ cDNA ပေါင်းစပ်မှုကို ပိုမိုမြင့်မားသော အပူချိန်တွင် လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး၊ မြင့်မားသော ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံဖြင့် RNAs ၏ အောင်မြင်သော စာသားမှတ်တမ်းကို အာမခံကာ၊ တုံ့ပြန်မှုတစ်လျှောက်လုံး ၎င်းတို့၏ အပြည့်အဝလုပ်ဆောင်မှုကို ထိန်းသိမ်းထားကာ cDNA အထွက်နှုန်း ပိုမြင့်မားစေသည်။

ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-

Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase

Reverse transcriptase ၏ RNase H လုပ်ဆောင်ချက်

RNaseH သည် RNA ကြိုးများကို RNA-DNA duplexes များမှ ချေဖျက်နိုင်ပြီး၊ ကြိုးနှစ်ထပ် DNA ၏ ထိရောက်စွာပေါင်းစပ်မှုကို ခွင့်ပြုနိုင်သည်။သို့သော်၊ ရှည်လျားသော mRNA ကို နမူနာပုံစံအဖြစ် အသုံးပြုသောအခါ၊ RNA သည် အချိန်မတိုင်မီ ပျက်ယွင်းသွားကာ ဖြတ်တောက်ထားသော cDNA ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ထို့ကြောင့်၊ ရှည်လျားသော စာသားများကို ပေါင်းစပ်လိုလျှင် cDNA cloning လုပ်နေစဉ် RNaseH လုပ်ဆောင်ချက်ကို လျှော့ချရန် မကြာခဏ အကျိုးရှိသည်။ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ RNase H လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းများသည် PCR ၏ပထမစက်ဝန်းအတွင်း RNA-DNA နှစ်ခုခွဲများ အရည်ပျော်ခြင်းကို မြှင့်တင်ပေးသောကြောင့် qPCR အက်ပ်လီကေးရှင်းများအတွက် အကျိုးရှိလေ့ရှိပါသည်။

Primer ဒီဇိုင်း

RT-qPCR တွင် qPCR အဆင့်အတွက်အသုံးပြုသော PCR primer များသည် exon-exon junction ကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် အမှန်တကယ် exon-intro နယ်နိမိတ်ကို ချဲ့ထွင်ရန် စိတ်ကူးယဉ်သင့်ပါသည်။အင်ထရွန်ပါရှိသော မျိုးရိုးဗီဇ DNA အစီအစဉ်များကို ချဲ့ထွင်ခြင်းမပြုသောကြောင့်၊ ဤဒီဇိုင်းသည် မျိုးရိုးဗီဇ DNA ညစ်ညမ်းခြင်းမှ ချဲ့ထွင်ထားသော အတုအယောင်အပြုသဘောများ ဖြစ်နိုင်ခြေကို လျှော့ချပေးပါသည်။

အကယ်၍ primer များသည် exons သို့မဟုတ် exon-exon နယ်နိမိတ်များကို ခွဲခြားရန် ဒီဇိုင်းထုတ်၍မရပါက၊ မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ DNA ညစ်ညမ်းမှုကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် RNA နမူနာများကို RNase-free DNase I သို့မဟုတ် dsDNase ဖြင့် ကုသရန် လိုအပ်နိုင်ပါသည်။

RT-qPCR ထိန်းချုပ်မှု

DNA ညစ်ညမ်းမှုကို ရှာဖွေရန် (ယခင်တုံ့ပြန်မှုများမှ မျိုးရိုးဗီဇ DNA သို့မဟုတ် PCR ထုတ်ကုန်များကဲ့သို့) RT-qPCR စမ်းသပ်မှုအားလုံးတွင် ပြောင်းပြန်စာသားအနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်မှု (-RT ထိန်းချုပ်မှု) ကို ထည့်သွင်းသင့်သည်။ဤထိန်းချုပ်မှုတွင် reverse transcriptase မှလွဲ၍ တုံ့ပြန်မှုဆိုင်ရာ အစိတ်အပိုင်းအားလုံး ပါရှိသည်။ဤထိန်းချုပ်မှုဖြင့် ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း မဖြစ်ပေါ်သောကြောင့် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းကို တွေ့ရှိပါက DNA မှ ညစ်ညမ်းမှု ဖြစ်နိုင်ချေများပါသည်။