1. အခြေခံဗဟုသုတ (စမ်းသပ်မှုအပိုင်းကို ကြည့်လိုပါက ဒုတိယအပိုင်းသို့ တိုက်ရိုက်လွှဲပြောင်းပေးပါ)
သမားရိုးကျ PCR ၏ ဆင်းသက်လာသော တုံ့ပြန်မှုတစ်ခုအနေဖြင့်၊ Real time PCR သည် fluorescence signal ၏ပြောင်းလဲမှုမှတစ်ဆင့် PCR amplification တုံ့ပြန်မှု စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် ချဲ့ထွင်သည့်ပမာဏပြောင်းလဲမှုကို အဓိကအားဖြင့် စောင့်ကြည့်စစ်ဆေးပြီး ct တန်ဖိုးနှင့် စံမျဉ်းကွေးကြားရှိ ဆက်စပ်မှုမှတစ်ဆင့် စတင်သည့်ပုံစံကို အရေအတွက်ပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါသည်။
RT-PCR ၏ တိကျသော ဒေတာများအခြေခံစာရင်း, fluorescence အဆင့်နှင့်Ct တန်ဖိုး။
| အခြေခံလိုင်း- | 3rd-15th cycle ၏ fluorescence တန်ဖိုးသည် တိုင်းတာမှု၏ ရံဖန်ရံခါ မှားယွင်းမှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသည့် အခြေခံလိုင်း (baseline) ဖြစ်သည်။ |
| အဆင့် (အဆင့်)- | ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၏ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်း၏ စံနှုန်းသွေဖည်မှု 10 ဆ ရှိသော သင့်လျော်သော အနေအထားတွင် သတ်မှတ်ထားသော fluorescence ကန့်သတ်ချက်ကို ရည်ညွှန်းသည်။ |
| CT တန်ဖိုး- | တုံ့ပြန်မှုပြွန်တစ်ခုစီရှိ fluorescence တန်ဖိုးသည် အဆင့်သတ်မှတ်ချက်သို့ရောက်ရှိသောအခါ PCR လည်ပတ်မှုအရေအတွက်ဖြစ်သည်။ Ct တန်ဖိုးသည် ကနဦးပုံစံပလိတ်ပမာဏနှင့် ပြောင်းပြန်အချိုးကျသည်။ |
RT-PCR အတွက် အသုံးများသော အညွှန်းရေးနည်းများ
| နည်းလမ်း | အားသာချက် | ချို့ယွင်းချက် | လျှောက်လွှာ၏နယ်ပယ် |
| SYBR အစိမ်းရောင်Ⅰ | ကျယ်ပြန့်စွာအသုံးချနိုင်မှု၊ ထိလွယ်ရှလွယ်၊ စျေးပေါပြီး အဆင်ပြေသည်။ | Primer လိုအပ်ချက်များသည် မြင့်မားသည်၊ အတိအကျမဟုတ်သော band များ ကျရောက်တတ်သည်။ | ၎င်းသည် အမျိုးမျိုးသောပစ်မှတ်မျိုးဗီဇများကို အရေအတွက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း၊ မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြခြင်းဆိုင်ရာ သုတေသနပြုခြင်းနှင့် transgenic recombinant တိရစ္ဆာန်များနှင့် အပင်များဆိုင်ရာ သုတေသနပြုခြင်းအတွက် သင့်လျော်သည်။ |
| TaqMan | ကောင်းမွန်သောတိကျမှုနှင့် ထပ်တလဲလဲနိုင်မှု မြင့်မားသည်။ | စျေးနှုန်းမြင့်မားပြီး တိကျသောပန်းတိုင်များအတွက်သာ သင့်လျော်ပါသည်။ | ရောဂါပိုးရှာဖွေခြင်း၊ ဆေးဝါးခံနိုင်ရည်ရှိသော မျိုးဗီဇ သုတေသန၊ ဆေးဝါးထိရောက်မှု အကဲဖြတ်ခြင်း၊ မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ ရောဂါများကို ဖော်ထုတ်ခြင်း။ |
| မော်လီကျူး မီးရှူးတန်ဆောင် | မြင့်မားသောတိကျမှု၊ မီးချောင်း၊ နောက်ခံနိမ့် | စျေးနှုန်းမြင့်သည်၊ တိကျသောရည်ရွယ်ချက်အတွက်သာသင့်လျော်သည်၊ ဒီဇိုင်းသည်ခက်ခဲသည်၊ စျေးနှုန်းမြင့်မားသည်။ | တိကျသောမျိုးဗီဇခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ SNP ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု |
2. စမ်းသပ်အဆင့်များ
2.1 စမ်းသပ်အုပ်စုဖွဲ့ခြင်းအကြောင်း- အဖွဲ့တွင် ရေတွင်းများစွာရှိရမည်ဖြစ်ပြီး ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထပ်လောင်းမှုများရှိရမည်။
| ① | အလွတ်ထိန်း | စမ်းသပ်မှုများတွင် ဆဲလ်ကြီးထွားမှုအခြေအနေကို သိရှိရန် အသုံးပြုသည်။ |
| ② | အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ် siRNA (အတိအကျမဟုတ်သော siRNA အစီအစဉ်) | RNAi လုပ်ဆောင်ချက်၏ တိကျမှုကို ပြသပါ။siRNA သည် 200nM အာရုံစူးစိုက်မှုတွင် အတိအကျမဟုတ်သော ဖိအားတုံ့ပြန်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သည်။ |
| ③ | Transfection Reagent ထိန်းချုပ်မှု | ဆဲလ်များသို့ ကူးပြောင်းသည့် ဓာတ်ပစ္စည်းများ၏ အဆိပ်အတောက် သို့မဟုတ် ပစ်မှတ် ဗီဇဖော်ပြမှုအပေါ် သက်ရောက်မှုကို ဖယ်ထုတ်ပါ |
| ④ | siRNA သည် ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇကိုဆန့်ကျင်သည်။ | ပစ်မှတ်ဗီဇ၏အသုံးအနှုန်းကို ဖြုတ်ပါ။ |
| ⑤ (ချန်လှပ်ထားနိုင်သည်) | အပြုသဘောဆောင်သော siRNA | စမ်းသပ်မှုစနစ်နှင့် လုပ်ငန်းဆောင်ရွက်မှုဆိုင်ရာ ပြဿနာများကို ဖြေရှင်းရန် အသုံးပြုသည်။ |
| ⑥ (ချန်လှပ်ထားနိုင်သည်) | ရောင်ရမ်းထိန်းချုပ်မှု siRNA | ဆဲလ်ကူးပြောင်းခြင်း၏ ထိရောက်မှုကို အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးဖြင့် ကြည့်ရှုနိုင်သည်။ |
2.2 primer ဒီဇိုင်းအခြေခံမူများ
| ချဲ့ထားသောအပိုင်းအစအရွယ်အစား | ဖြစ်နိုင်ရင် 100-150bp မှာ |
| Primer အရှည် | 18-25bp |
| GC အကြောင်းအရာ | 30%-70%, ဖြစ်နိုင်ရင် 45%-55% |
| Tm တန်ဖိုး | 58-60 ℃ |
| တစ်ဆက်တည်း | T/C အဆက်မပြတ် ရှောင်ပါ။A/G စဉ်ဆက်မပြတ် |
| 3 အဆုံး sequence | GC ကြွယ်ဝသော သို့မဟုတ် AT ကြွယ်ဝမှုကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။terminal base သည် ပိုကောင်းသည် G သို့မဟုတ် C;T ကို ရှောင်တာ အကောင်းဆုံးပါ။ |
| အဖြည့် | primer အတွင်း သို့မဟုတ် primer နှစ်ခုကြားတွင် အခြေခံ 3 ခုထက်ပိုသော အဆက်များကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။ |
| တိကျမှု | primer အတိအကျကို အတည်ပြုရန် ပေါက်ကွဲမှုရှာဖွေမှုကို အသုံးပြုပါ။ |
①SiRNA သည် မျိုးစိတ်အလိုက်ဖြစ်ပြီး မတူညီသောမျိုးစိတ်များ၏ အစီအမံများသည် ကွဲပြားမည်ဖြစ်သည်။
②SiRNA ကို အခန်းအပူချိန်တွင် 2-4 ပတ်ကြာ တည်ငြိမ်စွာ သိမ်းဆည်းနိုင်သော အအေးခန်းအခြောက်မှုန့်ဖြင့် ထုပ်ပိုးထားသည်။
2.3 ကြိုတင်ပြင်ဆင်ထားရန်လိုအပ်သော ကိရိယာများ သို့မဟုတ် ဓာတ်ပစ္စည်းများ
| Primer (အတွင်းပိုင်း ရည်ညွှန်းချက်) | ရှေ့နှင့် နောက်ပြန် နှစ်ခု ပါဝင်သည်။ |
| Primers (ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇ) | ရှေ့နှင့် နောက်ပြန် နှစ်ခု ပါဝင်သည်။ |
| ပစ်မှတ် Si RNA (3 strips) | ယေဘုယျအားဖြင့် ကုမ္ပဏီသည် အကွက် 3 ခုကို ပေါင်းစပ်ပြီး RT-PCR ဖြင့် သုံးခုထဲမှ တစ်ခုကို ရွေးချယ်မည်၊ |
| Transfection Kit | Lipo2000 စသည်တို့ |
| RNA အမြန်ထုတ်ယူခြင်းကိရိယာ | ကူးပြောင်းပြီးနောက် RNA ထုတ်ယူမှုအတွက် |
| Rapid Reverse Transcription Kit | cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက် |
| PCR Amplification Kit | 2× Super SYBR အစိမ်းရောင် qPCR Master Mix |
2.4 တိကျသောစမ်းသပ်အဆင့်များတွင်အာရုံစိုက်ရမည့်ကိစ္စရပ်များနှင့်စပ်လျဉ်း၍-
①siRNA ကူးပြောင်းမှုဖြစ်စဉ်
1. ပလပ်စတစ်အတွက်၊ သင်သည် 24-well plate၊ 12-well plate သို့မဟုတ် 6-well plate (24-well plate တစ်ခုစီတွင် အဆိုပြုထားသော ပျမ်းမျှ RNA အာရုံစူးစိုက်မှုမှာ 100-300 ng/uL ခန့်) နှင့် အကောင်းဆုံးသော transfection density သည် 60%-80% အထိဖြစ်သည်။
2. လွှဲပြောင်းခြင်းအဆင့်များနှင့် တိကျသောလိုအပ်ချက်များသည် ညွှန်ကြားချက်များနှင့်အညီ တင်းကြပ်စွာဆောင်ရွက်ပါသည်။
3. ရောဂါပိုးကူးစက်ပြီးနောက်၊ နမူနာများကို mRNA ထောက်လှမ်းခြင်း (RT-PCR) သို့မဟုတ် 48-96 နာရီအတွင်း (WB) အတွင်း ပရိုတင်းဓာတ်ရှာဖွေခြင်းအတွက် နမူနာများကို စုဆောင်းနိုင်သည်။
② RNA ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်
1. exogenous အင်ဇိုင်းများဖြင့် ညစ်ညမ်းမှုကို တားဆီးသည်။၎င်းတွင် အဓိကအားဖြင့် နှာခေါင်းစည်းများနှင့် လက်အိတ်များကို တင်းကြပ်စွာဝတ်ဆင်ခြင်း ပါဝင်သည်။ပိုးသတ်ထားသောပိုက်များနှင့် EP ပြွန်များကိုအသုံးပြု၍စမ်းသပ်မှုတွင်အသုံးပြုသောရေသည် RNase-Free ဖြစ်ရပါမည်။
2. သန့်ရှင်းမှုနှင့် အထွက်နှုန်းကို အမှန်တကယ်တိုးတက်စေမည့် အမြန်ထုတ်ယူမှုအစုံတွင် အကြံပြုထားသည့်အတိုင်း နှစ်ကြိမ်ပြုလုပ်ရန် အကြံပြုထားသည်။
3. စွန့်ပစ်အရည်သည် RNA ကော်လံကို မထိရပါ။
③ RNA ပမာဏ
RNA ကို ထုတ်ယူပြီးနောက်၊ ၎င်းကို Nanodrop ဖြင့် တိုက်ရိုက် တိုင်းတာနိုင်ပြီး အနိမ့်ဆုံး စာဖတ်နှုန်းသည် 10ng/ul အထိ နည်းပါးနိုင်သည်။
④ Reverse transcription လုပ်ငန်းစဉ်
1. RT-qPCR ၏ မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းကြောင့်၊ နောက်ဆက်တွဲ Ct သည် ကွဲပြားလွန်းခြင်း သို့မဟုတ် SD သည် စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ကြီးမားလွန်းခြင်းမှ ကာကွယ်ရန် နမူနာတစ်ခုစီအတွက် အနည်းဆုံး အပြိုင်ရေတွင်း 3 ခု ပြုလုပ်သင့်သည်။
2. အေးခဲပြီး ရောမွှေပါ Master ကို ထပ်ခါတလဲလဲ မရောပါနဲ့။
3. ပြွန်/အပေါက်တစ်ခုစီကို ထိပ်ဖျားအသစ်ဖြင့် အစားထိုးရမည်။နမူနာများထည့်ရန် တူညီသော pipette ထိပ်ဖျားကို ဆက်တိုက်မသုံးပါနှင့်။
4. နမူနာကိုထည့်ပြီးနောက် 96-ကောင်းစွာပန်းကန်ပြားတွင်တွဲထားသောရုပ်ရှင်ကိုပန်းကန်ပြားတစ်ခုဖြင့်ချောမွေ့ရန်လိုအပ်သည်။စက်ပေါ်မတင်ခင် centrifuge လုပ်တာ အကောင်းဆုံးဖြစ်ပြီး၊ tube wall ပေါ်က အရည်တွေ စီးဆင်းပြီး လေပူဖောင်းတွေကို ဖယ်ရှားနိုင်စေဖို့ အကောင်းဆုံးပါပဲ။
⑤ သာမန်မျဉ်းကွေး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
| လော့ဂရစ်သမ် ကြီးထွားမှုကာလ မရှိပါ။ | ပုံစံခွက်၏ အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားနိုင်သည်။ |
| CT တန်ဖိုးမရှိပါ။ | ချောင်းအချက်ပြမှုများကို ထောက်လှမ်းခြင်းအတွက် မှားယွင်းသောအဆင့်များ; primers သို့မဟုတ် probes များ ပျက်စီးခြင်း - ၎င်း၏ ကြံ့ခိုင်မှုကို PAGE electrophoresis ဖြင့် သိရှိနိုင်သည်။ နမူနာပုံစံမလုံလောက်ခြင်း၊ နမူနာပုံစံများ ပျက်စီးခြင်း - နမူနာပြင်ဆင်မှုတွင် အညစ်အကြေးများကို ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲခြင်းနှင့် အရည်ပျော်ခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ခြင်း၊ |
| Ct>၃၈ | ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည် နည်းပါးခြင်း၊PCR ထုတ်ကုန်သည် ရှည်လွန်းသည်။အမျိုးမျိုးသော တုံ့ပြန်မှု အစိတ်အပိုင်းများ ပျက်စီးသွားသည်။ |
| Linear amplification မျဉ်းကွေး | ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲသွားသော စက်ဝိုင်းများ သို့မဟုတ် အလင်းရောင်ကို ကြာရှည်စွာ ထိတွေ့ခြင်းကြောင့် အစိတ်အပိုင်းများ ပျက်စီးသွားနိုင်သည်။ |
| ထပ်နေသောအပေါက်များတွင် ကွာခြားချက်မှာ အထူးကြီးမားသည်။ | တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်သည် လုံးဝအရည်ပျော်ခြင်းမရှိပါ သို့မဟုတ် တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက် ရောနှောခြင်းမရှိပါ။PCR တူရိယာ၏အပူရေချိုးခန်းသည် fluorescent ပစ္စည်းများဖြင့် ညစ်ညမ်းနေသည်။ |
2.5 ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအကြောင်း
qPCR ၏ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို နှိုင်းရအရေအတွက်နှင့် အကြွင်းမဲ့အရေအတွက်အဖြစ် ပိုင်းခြားနိုင်သည်။ဥပမာအားဖြင့် ကုသရေးအုပ်စုအတွင်းရှိ ဆဲလ်များနှင့် ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုအတွင်းရှိ ဆဲလ်များ၊
X gene ၏ mRNA သည် အကြိမ်မည်မျှ ပြောင်းလဲသည်၊ ၎င်းသည် နှိုင်းရအရေအတွက် ဖြစ်သည်။ဆဲလ်အချို့တွင်၊ X ဗီဇ၏ mRNA
စောင်ရေ ဘယ်လောက်ရှိလဲ၊ ဒါက ပကတိ ပမာဏပါ။အများအားဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် ကျွန်ုပ်တို့ အများဆုံးအသုံးပြုသည့်အရာသည် နှိုင်းရအရေအတွက်နည်းလမ်းဖြစ်သည်။အများအားဖြင့်၊2-ΔΔct နည်းလမ်းစမ်းသပ်မှုများတွင် အများဆုံးအသုံးပြုသည် ဖြစ်သောကြောင့် ဤနည်းလမ်းကိုသာ ဤနေရာတွင် အသေးစိတ် မိတ်ဆက်ပေးပါမည်။
2-ΔΔct နည်းလမ်း- ရရှိသောရလဒ်မှာ စမ်းသပ်အုပ်စုရှိ ပစ်မှတ်ဗီဇဖော်ပြမှုတွင် ကွာခြားချက်မှာ ထိန်းချုပ်အုပ်စုရှိ ပစ်မှတ်ဗီဇနှင့် ဆက်စပ်မှုဖြစ်သည်။ပစ်မှတ်ဗီဇနှင့် အတွင်းရည်ညွှန်းဗီဇနှစ်ခုလုံး၏ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်များသည် 100% နီးပါးဖြစ်ပြီး ဆွေမျိုးသွေဖည်မှု 5% ထက် မပိုစေရပါ။
တွက်နည်းမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်။
Δct ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု = ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုရှိ ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ ct တန်ဖိုး - ထိန်းချုပ်အုပ်စုရှိ အတွင်းကိုးကား ဗီဇ၏ ct တန်ဖိုး
Δct စမ်းသပ်အုပ်စု = စမ်းသပ်အုပ်စုရှိ ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ ct တန်ဖိုး - စမ်းသပ်အုပ်စုရှိ အတွင်းကိုးကား ဗီဇ၏ ct တန်ဖိုး
ΔΔct=Δct စမ်းသပ်အုပ်စု-Δct ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စု
နောက်ဆုံးတွင်၊ စကားရပ်အဆင့်ရှိ ခြားနားချက်အမြောက်အမြားကို တွက်ချက်ပါ။
Fold = 2-ΔΔct (excel လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် သက်ဆိုင်သော POWER)
ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-
စာတိုက်အချိန်- မေ ၂၀-၂၀၂၃
