qPCR စမ်းသပ်မှုများတွင်၊ primer ဒီဇိုင်းသည် အလွန်အရေးကြီးသော link တစ်ခုဖြစ်သည်။Primers များသည် သင့်လျော်သည်ဖြစ်စေ မသင့်လျော်သည်ဖြစ်စေ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် စံနှုန်းသို့ရောက်ရှိခြင်း ရှိ၊
ဒါဆို qPCR primer ရဲ့ တိကျမှုကို ဘယ်လိုပိုကောင်းအောင်လုပ်မလဲ။မြင့်မားသောချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်?
ယနေ့တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် သင့်အား qPCR primer များကို အတူတကွ ဒီဇိုင်းဆွဲပြီး qPCR primer ဒီဇိုင်းကို လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများတွင် ထိရောက်သောဒဏ္ဍာရီကျွမ်းကျင်မှုတစ်ခု ဖြစ်လာစေမည်ဖြစ်သည်။
qPCR primers များကို ဒီဇိုင်းဆွဲသည့်အခါ၊ များသောအားဖြင့် အောက်ပါအချက်များကို အာရုံစိုက်ပါ- primer များသည် introns များကို တတ်နိုင်သမျှ ဖြတ်ပြီး ဒီဇိုင်းထုတ်သင့်သည်၊ ထုတ်ကုန်၏ အရှည်သည် 100-300 bp ဖြစ်သင့်သည်၊ Tm တန်ဖိုးသည် ဖြစ်နိုင်သမျှ 60°C နှင့်နီးစပ်သင့်သည်၊ နှင့် upstream နှင့် downstream primers များသည် အနီးစပ်ဆုံးဖြစ်သင့်ပြီး primer ၏အဆုံးသည် G သို့မဟုတ် C ဖြစ်သင့်ပါသည်။
1. introns ပတ်ပတ်လည် primers ဒီဇိုင်း
qPCR primers များကို ဒီဇိုင်းဆွဲသည့်အခါ၊ introns တစ်လျှောက် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော primers ရွေးချယ်ခြင်းသည် gDNA ပုံစံကို ချဲ့ထွင်ခြင်းမှ တားဆီးနိုင်ပြီး ထုတ်ကုန်များအားလုံးသည် cDNA ၏ ချဲ့ထွင်မှုမှ ဆင်းသက်လာသောကြောင့် gDNA ညစ်ညမ်းမှု၏ လွှမ်းမိုးမှုကို ဖယ်ရှားပေးပါသည်။
2. Primer အရှည်
primer အရှည်သည် ယေဘူယျအားဖြင့် 18-30 nt အကြားဖြစ်ပြီး၊ အသံချဲ့စက်၏အရှည်ကို တတ်နိုင်သမျှ 100-300 bp ကြားတွင် ထိန်းချုပ်သင့်သည်။
primer တိုလွန်းပါက၊ အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုဆီသို့ ဦးတည်သွားမည်ဖြစ်ပြီး ရှည်လွန်းပါက၊ ၎င်းသည် ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံ (ဆံပင်ညှပ်ပုံစံကဲ့သို့) လွယ်ကူစွာ ဖွဲ့စည်းနိုင်မည်ဖြစ်သည်။အသံချဲ့စက် ထုတ်ကုန်သည် ရှည်လွန်းပါက၊ PCR ချဲ့ထွင်မှု၏ ထိရောက်မှုကို ထိခိုက်စေမည့် Polymerase တုံ့ပြန်မှုအတွက် မသင့်လျော်ပါ။
3. GC အကြောင်းအရာနှင့် Tm တန်ဖိုး
Primers ၏ GC ပါဝင်မှုကို 40% နှင့် 60% ကြား ထိန်းချုပ်ထားသင့်သည်။မြင့်မားသည် သို့မဟုတ် နိမ့်လွန်းပါက၊ တုံ့ပြန်မှုကို စတင်ရန် အထောက်အကူမပြုပါ။တူညီသော Tm တန်ဖိုးနှင့် annealing temperature ကိုရရှိရန်အတွက် ရှေ့နှင့်နောက်ပြန် primers များ၏ GC ပါဝင်မှုသည် တူညီနေသင့်သည်။
Tm တန်ဖိုးသည် တတ်နိုင်သမျှ 55-65°C အကြားရှိသင့်သည်၊ ယေဘုယျအားဖြင့် 60°C ဝန်းကျင်ဖြစ်သင့်ပြီး အထက်ပိုင်းနှင့် မြစ်အောက်ပိုင်း၏ Tm တန်ဖိုးသည် 4°C ထက်မပိုသင့်ပါ။
4. primer ၏ 3′ အဆုံးတွင် A ကိုရွေးချယ်ခြင်းမှရှောင်ကြဉ်ပါ။
primer ၏ 3′ အဆုံးသည် မကိုက်ညီသောအခါ၊ မတူညီသော bases များ၏ပေါင်းစပ်မှုထိရောက်မှုတွင် ကြီးမားသောကွာခြားချက်များရှိပါသည်။နောက်ဆုံးအခြေသည် A ဖြစ်သောအခါ၊ ၎င်းသည် မကိုက်ညီသည့်ကိစ္စတွင်ပင် ကွင်းဆက်ပေါင်းစပ်မှုကို စတင်နိုင်သည်၊ နောက်ဆုံးအခြေခံသည် T ဖြစ်သောအခါ၊ မကိုက်ညီသော induction ၏ထိရောက်မှုမှာ အလွန်လျော့ကျသွားပါသည်။ထို့ကြောင့် primer ၏ 3′ အဆုံးတွင် A ကိုမရွေးချယ်ဘဲ T ကိုရွေးချယ်ခြင်းသည်ပိုကောင်းသည်။
အကယ်၍ ၎င်းသည် probe primer ဖြစ်ပါက၊ probe ၏ 5′ သည် G ဖြစ်မည်မဟုတ်ပါ၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် G base တစ်ခုသည် FAM ချောင်းသတင်းထောက်အဖွဲ့နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော်လည်း G သည် FAM အဖွဲ့မှ ထုတ်လွှတ်သော fluorescent signal ကို ငြိမ်းစေပြီး မှားယွင်းသောရလဒ်များကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ပေါ်လာ။
5. အခြေခံဖြန့်ချီရေး
primer တွင် base လေးခုကို ဖြန့်ခွဲခြင်းသည် ဖြစ်နိုင်ရင် ကျပန်းဖြစ်ပြီး 3′ အဆုံးတွင် 3′ ဆက်တိုက် G သို့မဟုတ် C ထက်ပို၍ 3 ကြိမ်ထက်ပိုသော ဆက်တိုက်ကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။G သို့မဟုတ် C သည် GC ကြွယ်ဝသော စီတန်းဒေသတွင် တွဲချိတ်ခြင်းကို လွယ်ကူစွာ ထုတ်လုပ်နိုင်သည်။
6. primer ဒီဇိုင်းဧရိယာသည် ရှုပ်ထွေးသော ဒုတိယအဆောက်အဦများကို ရှောင်ရှားသင့်သည်။
ချဲ့ထွင်ခြင်းထုတ်ကုန်၏ ကြိုးမျှင်တစ်ခုတည်းဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် PCR ၏ ချောမွေ့တိုးတက်မှုအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိမည်ဖြစ်သည်။ပစ်မှတ်အစီအစဥ်တွင် ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံရှိမရှိ ကြိုတင်ခန့်မှန်းခြင်းဖြင့်၊ primers ဒီဇိုင်းတွင် ဤဒေသကို ရှောင်ရှားရန် ကြိုးစားပါ။
7. primers များကိုယ်တိုင်နှင့် primers များကြားတွင် တစ်ဆက်တည်း အဖြည့်ခံများကို ရှောင်ရှားရန် ကြိုးစားသင့်သည်။
primer ကိုယ်တိုင်နှင့် primer ကြားတွင် အခြေခံ 4 ခု ဆက်တိုက် ဖြည့်စွမ်းမှု မရှိနိုင်ပါ။primer ကိုယ်တိုင်တွင် ဖြည့်စွက်အစီအစဥ် မပါဝင်သင့်ပါ၊ သို့မဟုတ်ပါက ၎င်းသည် primer နှင့် template ၏ annealing ပေါင်းစပ်မှုကို ထိခိုက်စေမည့် hairpin တည်ဆောက်ပုံအဖြစ် သူ့ဘာသာသူ ခေါက်သွားမည်ဖြစ်ပါသည်။
အထက်စီးကြောင်းနှင့် အောက်ရေစီးကြောင်း primers များကြားတွင် ဖြည့်စွက်အစီအစဥ်များ မတည်ရှိနိုင်ပါ။Primer များကြားတွင် ပေါင်းစပ်ပါဝင်မှုသည် PCR ထိရောက်မှုကို လျှော့ချနိုင်ပြီး အရေအတွက်တိကျမှုကိုပင် အကျိုးသက်ရောက်စေမည့် primer dimers များကို ထုတ်ပေးမည်ဖြစ်ပါသည်။primer-dimer နှင့် hairpin တည်ဆောက်ပုံများကို ရှောင်လွှဲ၍မရပါက၊ △G တန်ဖိုးသည် အလွန်မြင့်မားနေသင့်သည် (4.5 kcal/mol ထက်နည်းသင့်သည်)။
8. Primers များသည် ပစ်မှတ်သတ်မှတ်ထားသော ထုတ်ကုန်ကို ချဲ့ထွင်စေသည်။
qPCR ထောက်လှမ်းခြင်း၏ အဆုံးစွန်ပန်းတိုင်မှာ ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ များပြားမှုကို နားလည်ရန်ဖြစ်သည်။အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှု ဖြစ်ပေါ်ပါက၊ ပမာဏ မမှန်ပါ။ထို့ကြောင့်၊ primers များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ပြီးနောက်၊ ၎င်းတို့ကို BLAST ဖြင့် စမ်းသပ်ရန် လိုအပ်ပြီး ထုတ်ကုန်များ၏ တိကျမှုကို sequence database တွင် နှိုင်းယှဉ်ထားသည်။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသား၏ GAS6 (Growth arrest specific 6) gene ကို qPCR primers ဒီဇိုင်းပြုလုပ်ရန်အတွက် နမူနာအဖြစ် ယူဆောင်ပါသည်။
01 ဗီဇမေးမြန်းမှု
Homo GAS6NCBI မှတဆင့်ဤတွင်၊ ၎င်းတို့သည် တစ်သမတ်တည်းရှိစေရန် မျိုးဗီဇအမည်နှင့် မျိုးစိတ်များကို နှိုင်းယှဉ်ရန် အာရုံစိုက်သင့်သည်။
02 မျိုးဗီဇအစီအစဥ်ကိုရှာပါ။
(1) ပစ်မှတ် sequence သည် genomic DNA ဖြစ်ပါက gene ၏ genomic DNA sequence ဖြစ်သည့် ပထမတစ်ခုကို ရွေးချယ်ပါ။
(2) ပစ်မှတ် sequence သည် mRNA ဖြစ်ပါက ဒုတိယတစ်ခုကို ရွေးပါ။ဝင်ရောက်ပြီးပါက အောက်ပါဇယားရှိ “CDS” ကိုနှိပ်ပါ။အညိုရောင်နောက်ခံ sequence သည် gene ၏ coding sequence ဖြစ်သည်။
03 ဒီဇိုင်း primers
Primer-BLAST မျက်နှာပြင်ကို ထည့်သွင်းပါ။
ဘယ်ဘက်အပေါ်ပိုင်းရှိ Fasta ဖော်မတ်ရှိ မျိုးရိုးဗီဇ နံပါတ် သို့မဟုတ် အတွဲကို ထည့်သွင်းပြီး သက်ဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ဘောင်များကို ဖြည့်ပါ။

"Get primers" ကိုနှိပ်ပြီး NCBI သည် ထိုသို့သော ကန့်သတ်ချက်ရွေးချယ်မှုကို အခြား splicing မျိုးကွဲများသို့ ချဲ့ထွင်ပေးမည်ဖြစ်ကြောင်း သင့်အားပြောပြရန် NCBI ပေါ်လာပါမည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် မတူညီသော splicing မျိုးကွဲများကို စစ်ဆေးပြီး သင့်လျော်သော primer အတွဲ (အောက်ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း) ရရှိရန် ၎င်းတို့ကို တင်ပြနိုင်ပါသည်။ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို လုပ်ဆောင်ရန် စက္ကန့်ဆယ်ဂဏန်းကြာနိုင်သည်။
ဤ primer အတွဲများ၏ ရောနှောထားသော အပူချိန်သည် 60°C ဝန်းကျင်ဖြစ်သည်။စမ်းသပ်မှု၏ရည်ရွယ်ချက်အရ၊ အလယ်အလတ်အရှည်ရှိသော၊ ကောင်းမွန်သောတိကျမှုနှင့် စမ်းသပ်မှုအတွက် primers များကို ကိုယ်တိုင်ဖြည့်စွက်မှုနည်းသော primers ကိုရွေးချယ်ပါ၊ အောင်မြင်မှုနှုန်းသည် အလွန်မြင့်မားပါသည်။
04Primer တိကျသေချာမှုစစ်ဆေးခြင်း။
အမှန်မှာ၊ Primer-Blast သည် Primer ဒီဇိုင်းအပြင် ကျွန်ုပ်တို့ကိုယ်တိုင် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော primer များကိုလည်း အကဲဖြတ်နိုင်ပါသည်။primer ဒီဇိုင်းစာမျက်နှာသို့ ပြန်သွားပြီး၊ ကျွန်ုပ်တို့ ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော အထက်ရေစီးကြောင်းနှင့် အောက်ပိုင်း primer များကို ထည့်ပါ၊ အခြား ကန့်သတ်ချက်များကို ချိန်ညှိမည်မဟုတ်ပါ။တင်ပြပြီးနောက်၊ primers တစ်စုံသည် အခြားသော genes များတွင်လည်း ရှိမရှိကို ကြည့်ရှုနိုင်ပါသည်။၎င်းတို့အားလုံးကို ကျွန်ုပ်တို့ ချဲ့ထွင်လိုသော မျိုးရိုးဗီဇတွင် ပြသပါက၊ ဤ primers အတွဲ၏ တိကျမှုမှာ အလွန်ကောင်းမွန်ကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။(ဥပမာ၊ ဒါက primer query ရဲ့ တစ်ခုတည်းသောရလဒ်ပါ။)

05 Primer အရည်အသွေး စီရင်ခြင်း။
ဘယ်လို primer အမျိုးအစားက "ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုစံနှုန်းအထိ"၊ "ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်လက္ခဏာများ" နှင့် "ယုံကြည်စိတ်ချရသောစမ်းသပ်မှုရလဒ်များ" တို့ကိုပေါင်းစပ်ထားသည့် "ပြီးပြည့်စုံသော" primer အမျိုးအစားဖြစ်သည်။
ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်

အရည်ပျော်မျဉ်း
primers များ၏ ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှုသည် 90%-110% သို့ ရောက်ရှိပြီး ဆိုလိုသည်မှာ ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှု ကောင်းမွန်ကြောင်း၊ နှင့် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးသည် အထွတ်အထိပ် တစ်ခုတည်း ရှိပြီး များသောအားဖြင့် Tm>80°C၊ ဆိုလိုသည်မှာ ချဲ့ထွင်မှု တိကျမှု ကောင်းမွန်သည်ဟု ဆိုလိုသည်။
 
ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-
အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR လွယ်ကူသော-SYBR GREEN I
အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR လွယ်ကူသော-Taqman