မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေခြင်းနည်းပညာသည် လူ့ခန္ဓာကိုယ်၏ မျိုးရိုးဗီဇနှင့် အမျိုးမျိုးသော ရောဂါပိုးမွှားများ၏ အသွင်အပြင်နှင့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံကို သိရှိရန် မော်လီကျူးဇီဝဗေဒနည်းလမ်းများကို အသုံးပြုကာ ရောဂါများကို ကြိုတင်ခန့်မှန်းခြင်းနှင့် ရောဂါရှာဖွေခြင်း၏ ရည်ရွယ်ချက်ကို အောင်မြင်စေရန်အတွက် ဖြစ်သည်။

မကြာသေးမီနှစ်များအတွင်း၊ မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေရေးနည်းပညာကို အဆင့်မြှင့်တင်ခြင်းနှင့် ထပ်ခါထပ်ခါပြုလုပ်ခြင်းနှင့်အတူ၊ မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေခြင်းဆိုင်ရာ လက်တွေ့အသုံးချမှုမှာ ပိုမိုကျယ်ပြန့်ပြီး နက်ရှိုင်းလာကာ မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေရေးဈေးကွက်သည် လျင်မြန်စွာ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်လာသည့် ကာလတစ်ခုသို့ ဝင်ရောက်လာခဲ့သည်။

စာရေးသူသည် စျေးကွက်ရှိ ဘုံမော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေရေးနည်းပညာများကို အကျဉ်းချုပ်ဖော်ပြပြီး အပိုင်းသုံးပိုင်းခွဲထားသည်- ပထမအပိုင်းသည် PCR နည်းပညာကိုမိတ်ဆက်ပေးသည်၊ ဒုတိယအပိုင်းသည် nucleic acid isothermal amplification technology ကိုမိတ်ဆက်ပေးသည်၊ ဒုတိယအပိုင်းသည် sequencing နည်းပညာကိုမိတ်ဆက်ပေးသည်။

01

အပိုင်း ၁- PCR နည်းပညာ

PCR နည်းပညာ

PCR (polymerase ကွင်းဆက်တုံ့ပြန်မှု) သည် အနှစ် 30 ကျော်သမိုင်းနှင့်အတူ in vitro DNA ချဲ့ထွင်မှုနည်းပညာများထဲမှတစ်ခုဖြစ်သည်။

PCR နည်းပညာကို အမေရိကန်၊ Cetus မှ Kary Mullis မှ 1983 ခုနှစ်တွင် ရှေ့ဆောင်ခဲ့သည်။Mullis သည် PCR မူပိုင်ခွင့်အတွက် 1985 တွင် လျှောက်ထားခဲ့ပြီး ထိုနှစ်တွင် သိပ္ပံဆိုင်ရာ ပထမဆုံး PCR ပညာရပ်ဆိုင်ရာစာတမ်းကို ထုတ်ဝေခဲ့သည်။Mullis သည် 1993 ခုနှစ်တွင် ဓာတုဗေဒနိုဘယ်ဆုကို ရရှိခဲ့သည်။

PCR ၏အခြေခံမူများ

PCR သည် ပစ်မှတ် DNA အပိုင်းအစများကို အကြိမ်တစ်သန်းထက်ပို၍ ချဲ့နိုင်သည်။နိယာမမှာ DNA polymerase ၏ ဓာတ်ပြုမှုအောက်တွင်၊ parent strand DNA ကို ပုံစံပလိတ်တစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုပြီး တိုးချဲ့မှုအတွက် တိကျသော primer ကို အသုံးပြုသည်။၎င်းကို denaturation၊ annealing နှင့် extension များကဲ့သို့သော အဆင့်များမှတစ်ဆင့် vitro တွင် ပုံတူကူးထားသည်။မိဘကြိုးမျှင်ပုံစံ DNA ၏သမီးကြိုးမျှင် DNA ၏လုပ်ငန်းစဉ်။

စံ PCR လုပ်ငန်းစဉ်ကို အဆင့်သုံးဆင့် ခွဲထားသည်။

1. Denaturation- DNA နှစ်ဆကို ခွဲထုတ်ရန် မြင့်မားသော အပူချိန်ကို အသုံးပြုပါ။DNA နှစ်ထပ်ကြိုးများကြားရှိ ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများသည် မြင့်မားသောအပူချိန် (93-98°C) တွင် ကျိုးသွားပါသည်။

2. Annealing- ကြိုးနှစ်ထပ် DNA ကို ခွဲထုတ်ပြီးနောက်၊ primer သည် single-stranded DNA နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်စေရန် အပူချိန်ကို လျှော့ချသည်။

3. တိုးချဲ့မှု- အပူချိန် ကျဆင်းသွားသောအခါ DNA ပေါ်လီမာရတ်သည် ပေါင်းစပ်ထားသော ပရိုမာများထံမှ DNA ကြိုးများတစ်လျှောက် အဖြည့်ကြိုးများကို စတင်ပေါင်းစပ်သည်။တိုးချဲ့မှုကို ပြီးမြောက်သောအခါ၊ လည်ပတ်မှုတစ်ခုပြီးမြောက်ပြီး DNA အပိုင်းအစများ၏ အရေအတွက်သည် နှစ်ဆတိုးလာသည်။

ဤအဆင့်သုံးဆင့်ကို 25-35 ကြိမ်အပြန်အလှန်လုပ်ခြင်းဖြင့် DNA အပိုင်းအစများ၏အရေအတွက်သည် အဆတိုးလာမည်ဖြစ်သည်။

PCR ၏ ဉာဏ်ရည်ထက်မြက်မှုသည် မတူညီသော ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇများအတွက် ကွဲပြားသော primer များကို ဒီဇိုင်းထုတ်နိုင်သောကြောင့် ပစ်မှတ် gene အပိုင်းအစများကို အချိန်တိုအတွင်း ချဲ့ထွင်နိုင်မည်ဖြစ်သည်။

ယခုအချိန်အထိ PCR ကို သာမန် PCR၊ fluorescent quantitative PCR နှင့် digital PCR ဟူ၍ အမျိုးအစားသုံးမျိုး ခွဲခြားနိုင်သည်။

သာမန် PCR ၏ ပထမမျိုးဆက်

ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇကို ချဲ့ထွင်ရန် သာမန် PCR ချဲ့ထွင်သည့်ကိရိယာကို အသုံးပြုပါ၊ ထို့နောက် ထုတ်ကုန်ကိုသိရှိရန် agarose gel electrophoresis ကိုအသုံးပြု၍ အရည်အသွေးပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှသာ လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။

ပထမမျိုးဆက် PCR ၏အဓိကအားနည်းချက်များ

- အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်နှင့် မှားယွင်းသော အပြုသဘောဆောင်သော ရလဒ်များဆီသို့ ကျရောက်နေပါသည်။

- ထောက်လှမ်းခြင်းသည် အချိန်ကြာမြင့်ပြီး လုပ်ဆောင်ချက် ခက်ခဲသည်။

- အရည်အသွေးစစ်ဆေးခြင်းသာ လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။

ဒုတိယမျိုးဆက် fluorescence quantitative PCR

qPCR ဟုလည်းလူသိများသော Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR) ကို fluorescent signals များစုပုံခြင်းဖြင့် fluorescent signals များစုပုံခြင်းမှတဆင့် ချဲ့ထွင်ထားသော ထုတ်ကုန်များစုပုံခြင်းကို စောင့်ကြည့်ရန် အသုံးပြုပြီး တုံ့ပြန်မှုစနစ်၏တိုးတက်မှုကိုညွှန်ပြနိုင်သော fluorescent probes များကိုပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့် fluorescence မျဉ်းကွေးမှတဆင့် ရလဒ်များကို စီရင်ဆုံးဖြတ်ရန်၊ ၎င်းကို စံမျဉ်းကွေး၏တန်ဖိုးနှင့် စံနှုန်းဖြင့် တွက်ချက်နိုင်သည်။

qPCR နည်းပညာကို အလုံပိတ်စနစ်တွင် လုပ်ဆောင်သောကြောင့်၊ ညစ်ညမ်းမှုဖြစ်နိုင်ခြေကို လျော့ကျသွားကာ quantitative detection အတွက် fluorescence signal ကို စောင့်ကြည့်နိုင်သောကြောင့် ၎င်းသည် လက်တွေ့အလေ့အကျင့်တွင် အသုံးအများဆုံးဖြစ်ပြီး PCR တွင် လွှမ်းမိုးထားသောနည်းပညာဖြစ်လာသည်။

အချိန်နှင့်တပြေးညီ fluorescent quantitative PCR တွင်အသုံးပြုသည့် fluorescent အရာများကို- TaqMan fluorescent probes၊ molecular beacons နှင့် fluorescent dyes ဟူ၍ခွဲခြားနိုင်သည်။

1) TaqMan ချောင်းထောက်လှမ်းမှု-

PCR ချဲ့ထွင်မှုအတွင်း၊ primers တစ်စုံကို ထည့်စဉ်တွင် တိကျသော fluorescent probe ကို ထည့်သွင်းထားသည်။စူးစမ်းလေ့လာမှုသည် oligonucleotide ဖြစ်ပြီး၊ အစွန်းနှစ်ဖက်ကို သတင်းထောက်ချောင်းအုပ်စုနှင့် quencher fluorescent အုပ်စုဖြင့် အသီးသီးတံဆိပ်ကပ်ထားသည်။

စုံစမ်းစစ်ဆေးရေးအဖွဲ့သည် နဂိုအတိုင်းရှိနေသောအခါ သတင်းထောက်အဖွဲ့မှ ထုတ်လွှတ်သော ချောင်းအချက်ပြမှုကို quenching group မှ စုပ်ယူပါသည်။PCR ချဲ့ထွင်စဉ်တွင်၊ Taq အင်ဇိုင်း၏ 5′-3′ exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်သည် ပရိုတင်းကို ပြိုကွဲစေပြီး သတင်းထောက်အား ချောင်းများအုပ်စုနှင့် quencher ဖြစ်လာစေကာ fluorescent အုပ်စုကို ခွဲခြားထားသောကြောင့် fluorescence စောင့်ကြည့်ရေးစနစ်သည် fluorescence အချက်ပြမှုကို လက်ခံရရှိစေရန်၊ ဆိုလိုသည်မှာ DNA fluorescent strand ကို ချဲ့ထွင်လိုက်တိုင်း၊ a ၏ အချက်ပြမှုသည် fluorescent ဖြစ်သည်၊ PCR ထုတ်ကုန်ဖွဲ့စည်းခြင်းနှင့် လုံးဝထပ်တူပြုပါသည်။

2) SYBR ချောင်းဆိုးဆေး

PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် SYBR ချောင်းဆိုးဆေး၏ ပိုလျှံမှုကို ထည့်သွင်းထားသည်။SYBR ချောင်းဆိုးဆေးသည် DNA နှစ်ထပ်ကြိုးတွင် အတိအကျ မထည့်သွင်းပြီးနောက်၊ ၎င်းသည် ချောင်းအချက်ပြလှိုင်းကို ထုတ်လွှတ်သည်။ကွင်းဆက်တွင်မပါဝင်သည့် SYBR ဆိုးဆေးမော်လီကျူးသည် မည်သည့် fluorescent signal ကိုမျှ ထုတ်လွှတ်မည်မဟုတ်ပါ၊ ထို့ကြောင့် fluorescent signal ကိုသေချာစေခြင်းဖြင့် PCR ထုတ်ကုန်များ တိုးလာခြင်းသည် PCR ထုတ်ကုန်များ တိုးလာခြင်းနှင့် လုံးဝထပ်တူကျပါသည်။SYBR သည် ကြိုးနှစ်ထပ် DNA နှင့်သာ ချိတ်ဆက်ထားသောကြောင့် PCR တုံ့ပြန်မှုသည် တိကျမှုရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးကို အသုံးပြုနိုင်သည်။

3) မော်လီကျူး အလင်းတန်းများ

၎င်းသည် ပင်မကွင်းစဥ်နှစ်ထပ်တံဆိပ်ပါသော oligonucleotide ပလေယာတစ်ခုဖြစ်ပြီး 5 နှင့် 3 စွန်းတွင် အစွပ် 8 ခုခန့်ရှိသော ဆံပင်ညှပ်ဖွဲ့စည်းပုံဖြစ်သည်။အစွန်းနှစ်ဖက်ရှိ နျူကလိစ်အက်ဆစ်အစီအစဥ်များကို ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်ထားသောကြောင့် ချောင်းအုပ်စုနှင့် ငြိမ်းသတ်အုပ်စုကို တင်းကျပ်စေပါသည်။ပိတ်ပါ၊ ၎င်းသည် fluorescence ထွက်လာမည်မဟုတ်ပါ။

PCR ထုတ်ကုန်ကို ထုတ်လုပ်ပြီးနောက်၊ ဖြာထွက်သည့် လုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ မော်လီကျူးမီးရှူးတန်ဆောင်၏ အလယ်အပိုင်းကို တိကျသော DNA အစီအစဉ်တစ်ခုဖြင့် တွဲစပ်ထားပြီး ချောင်း၏ဗီဇသည် အလင်းဖြာထွက်စေရန် quencher gene မှ ခွဲထုတ်ထားသည်။

ဒုတိယမျိုးဆက် PCR ၏အဓိကအားနည်းချက်များ

အာရုံခံနိုင်စွမ်း အားနည်းနေသေးပြီး ကော်ပီနည်းနမူနာများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းသည် မတိကျပါ။

နောက်ခံတန်ဖိုးလွှမ်းမိုးမှုရှိပြီး ရလဒ်သည် ဝင်ရောက်စွက်ဖက်ရန် အလားအလာရှိသည်။

တတိယမျိုးဆက် ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR

ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR (DigitalPCR၊ dPCR၊ Dig-PCR) သည် အဆုံးမှတ်ထောက်လှမ်းခြင်းမှတစ်ဆင့် ပစ်မှတ်အစီအစဥ်၏ မိတ္တူနံပါတ်ကို တွက်ချက်ပြီး အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုများနှင့် စံမျဉ်းကွေးများကို အသုံးမပြုဘဲ တိကျသော ပမာဏရှာဖွေခြင်းကို လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။

ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR သည် အဆုံးမှတ်ထောက်လှမ်းမှုကို အသုံးပြုပြီး Ct တန်ဖိုး (စက်ဝန်းအဆင့်သတ်မှတ်မှု) ပေါ်တွင်မူတည်ခြင်းမရှိသောကြောင့် ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR တုံ့ပြန်မှုသည် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကြောင့် ထိခိုက်မှုနည်းပြီး PCR တုံ့ပြန်မှု inhibitors များကို မြင့်မားသောတိကျမှုနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုတို့ဖြင့် မြှင့်တင်ထားသည်။

မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် တိကျမှုမြင့်မားသော ဝိသေသလက္ခဏာများကြောင့်၊ ၎င်းကို PCR တုံ့ပြန်မှု inhibitors များက အလွယ်တကူ ဝင်ရောက်စွက်ဖက်ခြင်းမပြုဘဲ၊ သုတေသနနှင့် အပလီကေးရှင်း ဟော့စပေါ့ဖြစ်လာသည့် စံထုတ်ကုန်များမပါဘဲ စစ်မှန်သော အကြွင်းမဲ့ပမာဏကို ရရှိနိုင်သည်။

တုံ့ပြန်မှုယူနစ်၏ မတူညီသောပုံစံများအရ ၎င်းကို microfluidic၊ ချစ်ပ်နှင့် droplet စနစ်ဟူ၍ သုံးမျိုးခွဲခြားနိုင်သည်။