ခဲ

Long-coding မဟုတ်သော RNA၊ lncRNA သည် ယေဘုယျအားဖြင့် 200 မှ 100000 nt ကြားရှိသော နျူကလီးအိုရိုက် အရှည် 200 ထက်ကြီးသော ကုဒ်မဟုတ်သော RNA ဖြစ်သည်။lncRNA သည် epigenetic၊ transcription နှင့် post-transcriptional အဆင့်များတွင် မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုကို ထိန်းညှိပေးပြီး X chromosome အသံတိတ်ခြင်း၊ genome imprinting နှင့် chromatin ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်း၊ စာသားပြောင်းခြင်း၊ ကူးယူခြင်းဝင်ရောက်စွက်ဖက်ခြင်း၊ နျူကလီးယားသယ်ယူပို့ဆောင်ရေး၊ ဆဲလ်လည်ပတ်မှုစည်းမျဉ်း၊ ဆဲလ်ကွဲပြားမှုစည်းမျဉ်း၊ နှင့် ဆေးထိုးလျော်ကြေးသက်ရောက်မှုများ (Dosage လျော်ကြေးပေးသည့်အကျိုးသက်ရောက်မှု) နှင့် လူသားဆိုင်ရာ လုပ်ငန်းစဉ်များ ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းအတွက် အခြားသောအရေးကြီးသော စည်းမျဉ်းများဖြစ်ကြသည် လက်ရှိတွင် ဇီဝဆေးပညာနယ်ပယ်တွင် ရေပန်းစားသောနေရာများထဲမှ တစ်ခုဖြစ်သည်။

01  LncRNA ၏ အမျိုးအစားများနှင့် လက္ခဏာများ

lncRNA သည် အထက်ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း ၎င်း၏ဖွဲ့စည်းပုံ၏ မတူညီသောအရင်းအမြစ်များအလိုက် အမျိုးအစားများစွာ ခွဲခြားထားသည်။အောက်ပါလက္ခဏာများ ရှိသည်-

1. lncRNAs များသည် ကွဲပြားနေစဉ်အတွင်း တက်ကြွသောအသုံးအနှုန်းနှင့် ကွဲပြားသော splicing နည်းလမ်းများဖြင့် များသောအားဖြင့် ပိုရှည်သည်။
2. coding genes နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက lncRNA သည် အများအားဖြင့် နိမ့်ကျသော ဖော်ပြမှုအဆင့် ရှိပါသည်။
3. LncRNA အများစုတွင် တစ်သျှူးများ ကွဲပြားခြင်းနှင့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုဖြစ်စဉ်တွင် သိသာထင်ရှားသော ယာယီနှင့် spatial ဖော်ပြမှု တိကျမှုရှိသည်
4. အကျိတ်နှင့် အခြားရောဂါများတွင် လက္ခဏာရပ်များရှိသည်။
5. lncRNA ၏ အောက်ဆဲလ်တည်နေရာများသည် ကွဲပြားသည်။
6. အစီအစဥ်သည် ထိန်းသိမ်းမှုနည်းသော်လည်း လုပ်ဆောင်ချက်သည် ထိန်းသိမ်းမှုအတိုင်းအတာတစ်ခုအထိ စသည်တို့ရှိသည်။

02 LncRNA Reverse Transcription အကြောင်း အမေးများသောမေးခွန်းများ

ဆဲလ်များရှိ lncRNA ၏ပါဝင်မှုနည်းသော၊ ရှည်လျားပြီးအဆင့်မြင့်ဖွဲ့စည်းပုံကြောင့်၊ ယင်း RNA သည် ပင်မကွင်းများ သို့မဟုတ် ဆံထိုးများကဲ့သို့သော ရှုပ်ထွေးသောဖွဲ့စည်းပုံများရှိပြီး RT-qPCR သည် မအောင်မြင်သောပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း သို့မဟုတ် ထိရောက်မှုနည်းသောပြဿနာများအတွက် အလားအလာများပါသည်။

03 LncRNA ပြောင်းပြန်စာသားမှတ်တမ်းဖြေရှင်းချက်

ဗဟိုအုပ်ချုပ်မှုတွင်၊ ပုံစံပလိတ်တစ်ခုအနေဖြင့် RNA ကိုအသုံးပြု၍ DNA ကိုပေါင်းစပ်ရန် ၎င်းတို့၏ကိုယ်ပိုင်ပြောင်းပြန် transcriptase ကိုအသုံးပြု၍ RNA ဗိုင်းရပ်စ်များ၏လုပ်ငန်းစဉ်ကို reverse transcription ဟုခေါ်သည်။vitro တွင် cDNA နမူနာပုံစံကိုပေါင်းစပ်ရန် RNA virus reverse transcriptase ကိုအသုံးပြုခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို reverse transcription ဟုခေါ်သည်။ပြောင်းပြန် ကူးယူခြင်းစနစ်တွင် ပါဝင်သော အဓိကဒြပ်စင်များ- RNA နမူနာပုံစံ၊ ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း၊ primers နှင့် အခြားအစိတ်အပိုင်းများ။

1.RNA နမူနာပုံစံ

ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းအပေါ် RNA နမူနာပုံစံ၏ သြဇာလွှမ်းမိုးမှုကို ၎င်း၏ဖွဲ့စည်းပုံ၊ သန့်ရှင်းမှုနှင့် ခိုင်မာမှုတွင် ထင်ဟပ်စေသည်။ထုတ်ယူထားသော RNA ၏ သန့်ရှင်းမှုနှင့် ခိုင်မာမှု မြင့်မားလေ၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ ထိရောက်မှု မြင့်မားလေဖြစ်ပြီး နောက်ဆက်တွဲ ကိန်းဂဏန်းရလဒ်များ ပိုမိုတိကျလေဖြစ်သည်။အသုံးများသော RNA ထုတ်ယူသည့် ဓာတ်ပစ္စည်းများဖြင့် သန့်စင်သော RNA တွင် မကြာခဏ ပြောင်းပြန် transcriptase အများစုအပေါ် ပြင်းထန်သော တားဆီးမှုရှိသော အယ်လ်ကိုဟောနှင့် guanidine ဆားအကြွင်းအကျန်များပါရှိသည်။

2.Reverse transcriptase

Reverse transcriptase သည် ပြောင်းပြန် စာသားစနစ် တစ်ခုလုံးတွင် အဓိက လွှမ်းမိုးမှု ရှိပါသည်။ဓာတ်ခွဲခန်းအများစုတွင်အသုံးပြုသော reverse transcriptase အတွက် သင့်လျော်သောအပူချိန်မှာ ယေဘုယျအားဖြင့် 42°C ဖြစ်သည်။တကယ်တော့၊ အဆင့်မြင့်မားသော RNA ဖွဲ့စည်းပုံကိုဖွင့်ရန်ပိုမိုမြင့်မားသောအပူချိန်လိုအပ်ပြီး reverse transcriptase အတွက်လိုအပ်ချက်များပိုမိုမြင့်မားသည်။

3.Primer ပါ။

Reverse transcription primers များတွင် gene-specific primers၊ random primers နှင့် Oligo dT primers တို့ ပါဝင်သည်။lncRNA အများစုတွင် polyA အမြီးများမပါဝင်သဖြင့် Oligo dT နှင့် ကျပန်း primers များကို မှန်ကန်စွာ ကိုက်ညီရန် အရေးကြီးပါသည်။

4. အခြားအစိတ်အပိုင်းများ

RNA သည် အထူးချေဖျက်ရန် လွယ်ကူသောကြောင့် RNase ၏ ဝင်ရောက်မှုကို ထိထိရောက်ရောက် ဟန့်တားနိုင်ပြီး ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ ချောမွေ့တိုးတက်မှုကို သေချာစေရန်အတွက် အစိတ်အပိုင်းများ၏ နိဒါန်းကို လျှော့ချနိုင်သည်။

Fအော်ရီဂျင်RNA နမူနာပုံစံမှ ရယူပြီး၊ qPCR သို့ ပြောင်းပြန် စာသားကို ရယူသည်။

သင်၏ lncRNA ထောက်လှမ်းမှုကို ပြည့်စုံစွာ ပို့ဆောင်ပါ။

တိရစ္ဆာန်စုစုပေါင်း RNA IsolationKit (gDNA ဖယ်ရှားရေးကော်လံပါရှိသော)

ဆဲလ်စုစုပေါင်း RNA IsolationKit (gDNA ဖယ်ရှားရေးကော်လံပါရှိသော)

Lnc-RT HeroTM I(GDNase ဖြင့်)(lncRNA မှ ပထမတန်း cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက် Super Premix)

Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I

Aအားသာချက်များ ofRNA ထုတ်ယူခြင်း-

စက်ကိရိယာသည် တတိယမျိုးဆက် RNA ထုတ်ယူမှုနည်းပညာကို အသုံးပြုထားပြီး DNase ကို အသုံးပြုရန် မလိုအပ်ပါ။

96၊ 24၊ 12၊ နှင့် 6-ကောင်းစွာပန်းကန် မွေးမြူထားသောဆဲလ်များမှ 11 မိနစ်၊ gDNA မပါဘဲ၊ အရည်အသွေးမြင့်၊ အရည်အသွေးမြင့် စုစုပေါင်းဆဲလ် RNA ကို ထိရောက်စွာထုတ်ယူခြင်း။

lncRNA reverse transcription ၏အားသာချက်များ

မျိုးရိုးဗီဇ DNA ညစ်ညမ်းမှုကို လျင်မြန်စွာဖယ်ရှားရန် LncRNA အတွက် အထူးပြုလုပ်ထားသော ပြောင်းပြန်စာသားစနစ်။

ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းစနစ်သည် မြင့်မားသောအပူရှိန်တည်ငြိမ်မှုရှိပြီး 50°C တွင် ကောင်းသောပြောင်းပြန် စာသားပြောင်းခြင်းစွမ်းဆောင်မှုရှိပါသည်။

မြင့်မားသော GC အကြောင်းအရာနှင့် ရှုပ်ထွေးသော အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံပါရှိသော ပုံစံများကို စွမ်းဆောင်ရည်မြင့်မားစွာဖြင့် ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်သည်။

အားသာချက်များof qPCR-

Hot start Foregene Taq Polymerase သည် ပိုမိုမြင့်မားသော ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်၊ ပိုမိုများပြားသော ချဲ့ထွင်မှုအာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် ပိုမိုမြင့်မားသော ချဲ့ထွင်မှုဆိုင်ရာ တိကျမှုတို့ ပါဝင်သည်။

ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ထားသော Real PCR Easy Mix သည် SYBR Green I သည် ပိုမိုသိရှိနိုင်မှု အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို ရရှိစေပြီး ၎င်း၏ fluorescence ပြင်းအားသည် အလားတူထုတ်ကုန်များထက် 3-5 ဆဖြစ်ပြီး၊ ကွဲပြားသော fluorescence quantitative စမ်းသပ်မှုများ၏ လိုအပ်ချက်များကို ဖြည့်ဆည်းပေးနိုင်ပါသည်။