Ct တန်ဖိုးသည် fluorescent quantitative PCR ၏ အရေးကြီးဆုံးရလဒ်တင်ဆက်မှုပုံစံဖြစ်သည်။မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုကွဲပြားမှုများ သို့မဟုတ် ဗီဇမိတ္တူနံပါတ်များကို တွက်ချက်ရန် ၎င်းကိုအသုံးပြုသည်။ဒါဆို fluorescence quantification ရဲ့ Ct တန်ဖိုးက ဘာကို ကျိုးကြောင်းဆီလျော်တယ်လို့ ယူဆပါသလဲ။Ct တန်ဖိုး၏ ထိရောက်မှုအကွာအဝေးကို မည်သို့သေချာစေမည်နည်း။
Ct တန်ဖိုးဆိုတာဘာလဲ။
qPCR ချဲ့ထွင်မှုလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်၏ fluorescence အချက်ပြမှုသည် သတ်မှတ် fluorescence အဆင့်သို့ရောက်ရှိသောအခါ သက်ဆိုင်ရာ ချဲ့ထွင်သည့် စက်ဝန်းအရေအတွက် (Cycle Threshold)။C သည် Cycle နှင့် T သည် Threshold ဖြစ်သည် ။ရိုးရိုးရှင်းရှင်းပြောရလျှင်၊ Ct တန်ဖိုးသည် qPCR တွင် ထုတ်ကုန်အချို့ပမာဏသို့ ရောက်ရှိသောအခါတွင် သက်ဆိုင်သည့် သံသရာအရေအတွက်ဖြစ်သည်။“အချို့သော ကုန်ပစ္စည်းပမာဏ” ဟုခေါ်သည် ကို နောက်ပိုင်းတွင် ဆက်လက်ရှင်းပြပါမည်။
Ct တန်ဖိုးက ဘာအလုပ်လုပ်သလဲ။
1. ထပ်ကိန်းချဲ့ထွင်မှု၊ ပုံစံခွက်ပမာဏနှင့် Ct တန်ဖိုးတို့ကြား ဆက်စပ်မှု
အကောင်းဆုံးကတော့၊ qPCR မှာရှိတဲ့ genes တွေကို လည်ပတ်မှုအရေအတွက်တစ်ခုပြီးရင် exponential amplification နဲ့ စုဆောင်းပါတယ်။ချဲ့ထွင်သည့် စက်ဝန်းအရေအတွက်နှင့် ထုတ်ကုန်ပမာဏအကြား ဆက်စပ်မှုမှာ- ချဲ့ထွင်ထားသော ထုတ်ကုန်ပမာဏ = ကနဦး ပုံစံပလိတ်ပမာဏ × (1+En) သံသရာနံပါတ်။သို့သော်လည်း qPCR တုံ့ပြန်မှုသည် စံပြအခြေအနေတွင် အမြဲတမ်းမရှိပါ။ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်ပမာဏသည် "အချို့သောထုတ်ကုန်ပမာဏ" သို့ရောက်ရှိသောအခါ၊ ဤအချိန်တွင် သံသရာအရေအတွက်သည် Ct တန်ဖိုးဖြစ်ပြီး ၎င်းသည် အထပ်ကိန်းချဲ့သည့်ကာလတွင်ဖြစ်သည်။Ct တန်ဖိုး နှင့် စတင်သည့် ပုံစံခွက် ပမာဏကြား ဆက်စပ်မှု − ပုံစံပလိတ်၏ Ct တန်ဖိုး နှင့် ပုံစံပလိတ်၏ စတင် မိတ္တူ နံပါတ်၏ လော့ဂရစ်သမ် အကြား မျဉ်းကြောင်း ဆက်စပ်မှု ရှိသည်။ကနဦး ပုံစံပလိတ် အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားလေ၊ Ct တန်ဖိုး သေးငယ်လေ၊ကနဦး template အာရုံစူးစိုက်မှုနိမ့်လေ၊ Ct တန်ဖိုး ပိုကြီးလေဖြစ်သည်။
2.Amplification curve၊ fluorescence threshold နှင့် အချို့သော PCR ထုတ်ကုန်ပမာဏ
qPCR amplification ထုတ်ကုန်ပမာဏကို ချဲ့ထွင်ခြင်းမျဉ်းကြောင်းဖြစ်သည့် fluorescent အချက်ပြပုံစံဖြင့် တိုက်ရိုက်ပြသပါသည်။PCR ၏အစောပိုင်းအဆင့်တွင်၊ ချဲ့ထွင်မှုသည် စံပြအခြေအနေအောက်တွင်ရှိပြီး၊ သံသရာအရေအတွက်သည် သေးငယ်သည်၊ ထုတ်ကုန်စုဆောင်းမှုသည် သေးငယ်သည်၊ နှင့် fluorescence အဆင့်ကို fluorescence နောက်ခံနှင့် ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ခွဲခြားမရနိုင်ပါ။ထို့နောက်တွင်၊ fluorescence တိုးလာပြီး exponential အဆင့်သို့ ဝင်ရောက်သည်။PCR တုံ့ပြန်မှုသည် exponential အဆင့်တွင်သာရှိပြီး၊ "အချို့သောပမာဏ" အဖြစ်အသုံးပြုနိုင်သည့် PCR တုံ့ပြန်မှုအဆင့်တွင် PCR ထုတ်ကုန်၏ပမာဏကို သိရှိနိုင်ပြီး၊ ၎င်းမှ နမူနာပုံစံ၏ ကနဦးအကြောင်းအရာကို နုတ်ယူနိုင်သည်။ထို့ကြောင့်၊ ထုတ်ကုန်အချို့နှင့် သက်ဆိုင်သော fluorescence signal intensity သည် fluorescence threshold ဖြစ်သည်။
PCR ၏နှောင်းပိုင်းအဆင့်တွင်၊ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးသည် ကိန်းဂဏန်းချဲ့ထွင်မှုကို မပြသတော့ဘဲ မျဉ်းသားအဆင့်နှင့် ကုန်းပြင်မြင့်အဆင့်သို့ ဝင်ရောက်သည်။
3. Ct တန်ဖိုးများ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှု
PCR သံသရာသည် Ct တန်ဖိုး၏ သံသရာနံပါတ်သို့ ရောက်ရှိသောအခါ၊ ၎င်းသည် စစ်မှန်သော အတိုးကိန်းချဲ့မှုကာလသို့ ရောက်ရှိသွားပါသည်။ဤအချိန်တွင်၊ သေးငယ်သော error ကို ချဲ့ထွင်ခြင်းမပြုရသေးသောကြောင့် Ct တန်ဖိုး၏ ပြန်ထုတ်နိုင်မှုသည် အလွန်ကောင်းမွန်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ တူညီသောပုံစံကို မတူညီသောအချိန်များတွင် သို့မဟုတ် မတူညီသောပြွန်များတွင် တစ်ချိန်တည်းတွင် ချဲ့ထွင်ထားသည်။ချဲ့ထွင်ခြင်း၊ ရရှိသော Ct တန်ဖိုးသည် ကိန်းသေဖြစ်သည်။
1.Amplification ထိရောက်မှု En
PCR ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှု ဆိုသည်မှာ ဗီဇကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် အမ်ပလီကွန်အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲပေးသည့် စွမ်းဆောင်ရည်ကို ရည်ညွှန်းသည်။DNA မော်လီကျူးတစ်ခုသည် DNA မော်လီကျူးနှစ်ခုအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲသောအခါ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် 100% ဖြစ်သည်။Amplification efficiency ကို အများအားဖြင့် En အနေဖြင့် ဖော်ပြသည်။နောက်ဆက်တွဲဆောင်းပါးများ၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေရန်အတွက်၊ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို အကျိုးသက်ရောက်စေသည့်အချက်များအား အတိုချုံးမိတ်ဆက်ပေးပါသည်။
| လွှမ်းမိုးသောအချက်များ | ရှင်းလင်းချက် | ဘယ်လိုစီရင်ရမလဲ။ |
| A. PCR တားဆေးများ | 1. နမူနာပုံစံ DNA တွင် ပရိုတင်း သို့မဟုတ် ဆပ်ပြာများကဲ့သို့သော PCR တုံ့ပြန်မှုကို ဟန့်တားသည့် အရာများ ပါရှိသည်။2. ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြပြီးနောက် cDNA တွင် ပုံစံပလိတ် RNA သို့မဟုတ် RT ဓာတ်ပစ္စည်းများ၏ ပြင်းအား မြင့်မားစွာ ပါ၀င်သည်၊ ၎င်းသည် နောက်ဆက်တွဲ PCR တုံ့ပြန်မှုကို ဟန့်တားနိုင်သည်။ | 1. ညစ်ညမ်းမှုရှိမရှိ A260/A280 နှင့် A260/A230 သို့မဟုတ် RNA electrophoresis အချိုးကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် စစ်ဆေးစီရင်နိုင်ပါသည်။2. ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြပြီးနောက် အချို့သောအချိုးတစ်ခုအရ cDNA ကို မှေးမှိန်ခြင်းရှိမရှိ၊ |
| B. မသင့်လျော်သော primer ဒီဇိုင်း | Primers များသည် ပါးလွှာခြင်းကို ထိရောက်စွာ မလုပ်နိုင်ပါ။ | primer-dimers သို့မဟုတ် hairpins၊ မကိုက်ညီမှုများ၊ နှင့် တစ်ခါတစ်ရံတွင် intronic ဒီဇိုင်းများကို ပတ်ထားသော primer များကို စစ်ဆေးပါ။ |
| C. မမှန်သော PCR တုံ့ပြန်မှု ပရိုဂရမ် ဒီဇိုင်း | 1. Primers များသည် ထိရောက်စွာ မလိမ်းနိုင်ပါ။2. DNA polymerase မလုံလောက်ခြင်း။ 3. ရေရှည်မြင့်မားသော အပူချိန် DNA polymerase လုပ်ဆောင်မှု လျော့နည်းသွားသည်။ | 1. လိမ်းထားသော အပူချိန်သည် primer ၏ TM တန်ဖိုးထက် ပိုမြင့်သည်။2. Pre-denaturation time တိုလွန်းသည်။ 3. တုံ့ပြန်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်းအဆင့်တစ်ခုစီ၏အချိန်သည် ရှည်လွန်းသည်။ |
| D. ဓာတ်ပစ္စည်းများ ရောစပ်မှု မလုံလောက်ခြင်း သို့မဟုတ် ပိုက်ထုတ်ခြင်း အမှားအယွင်းများ | တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင်၊ PCR တုံ့ပြန်မှုအစိတ်အပိုင်းများ၏ ဒေသထွက်အာရုံစူးစိုက်မှုသည် မြင့်မားသည် သို့မဟုတ် မညီမညာဖြစ်ပြီး၊ PCR ချဲ့ထွင်မှု၏ ထပ်ကိန်းမဟုတ်သောချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ | |
| E. Amplicon အရှည် | amplicon ၏ အလျားသည် ရှည်လွန်းသည်၊ 300bp ထက်ကျော်လွန်ပြီး ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည် နိမ့်သည် | amplicon အရှည် 80-300bp အကြားရှိမရှိ စစ်ဆေးပါ။ |
| F. qPCR ဓာတ်ပစ္စည်းများ၏ လွှမ်းမိုးမှု | ဓာတ်ပစ္စည်းများတွင် DNA polymerase ၏အာရုံစူးစိုက်မှု နည်းပါးသည် သို့မဟုတ် ကြားခံအတွင်းရှိ အိုင်းယွန်းများ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုအား ပိုမိုကောင်းမွန်အောင် မလုပ်ဆောင်နိုင်သောကြောင့် Taq အင်ဇိုင်း၏ လုပ်ဆောင်ချက်သည် အမြင့်ဆုံးသို့ မရောက်နိုင်ပါ။ | စံမျဉ်းကွေးဖြင့် အသံချဲ့စက်၏ စွမ်းဆောင်ရည်ကို ဆုံးဖြတ်ခြင်း။ |
2.Range of Ct တန်ဖိုးများ
Ct တန်ဖိုးများသည် 15-35 မှ ကွာသည်။Ct တန်ဖိုးသည် 15 ထက်နည်းပါက၊ ချဲ့ထွင်မှုသည် အခြေခံမျဉ်းကာလ၏ အကွာအဝေးအတွင်းတွင်ရှိပြီး fluorescence အဆင့်သို့ မရောက်ရှိသေးဟု ယူဆပါသည်။အကောင်းဆုံးမှာ၊ စံမျဉ်းကွေးဆိုသည်မှာ နမူနာပုံစံ၏ ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်၏ လော့ဂရစ်သမ် Ct တန်ဖိုးနှင့် လော့ဂရစ်သမ်ကြားတွင် မျဉ်းကြောင်းဆက်နွယ်မှု ရှိပါသည်။စံမျဉ်းကွေးမှတဆင့်၊ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှု 100% ဖြစ်သောအခါ gene ၏တစ်ခုတည်းသောမိတ္တူနံပါတ်ကိုရေတွက်ရန်အတွက်တွက်ချက်ထားသော Ct တန်ဖိုးသည် 35 ဝန်းကျင်ဖြစ်သည်။ ၎င်းသည် 35 ထက်ကြီးပါက၊ နမူနာပုံစံ၏ကနဦးမိတ္တူအရေအတွက်သည် သီအိုရီအရ 1 ထက်နည်းသည်၊ အဓိပ္ပါယ်မရှိဟုယူဆနိုင်သည်။
မတူညီသော ဗီဇ Ct အပိုင်းအခြားများအတွက်၊ ဗီဇမိတ္တူအရေအတွက်နှင့် ကနဦးပုံစံပလိတ်ပမာဏတွင် ချဲ့ထွင်နိုင်မှု ကွာခြားချက်ကြောင့်၊ ဗီဇအတွက် စံမျဉ်းကွေးတစ်ခု ပြုလုပ်ရန်နှင့် gene ၏ linear detection range ကို တွက်ချက်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
3. Ct တန်ဖိုး၏ လွှမ်းမိုးမှုဆိုင်ရာအချက်များ
အသံချဲ့စက်အရေအတွက်နှင့် ထုတ်ကုန်ပမာဏအကြား ဆက်နွယ်မှု- အသံချဲ့စက်ပမာဏ = ကနဦးပုံစံပလိတ်ပမာဏ × (1+En) သံသရာနံပါတ်၊ စံပြအခြေအနေအောက်တွင်၊ ကနဦးပုံစံပလိတ်ပမာဏနှင့် En ပမာဏသည် Ct တန်ဖိုးအပေါ် အပျက်သဘောဆောင်သော အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိမည်ကို တွေ့မြင်နိုင်သည်။နမူနာပုံစံ အရည်အသွေး သို့မဟုတ် ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည် ကွာခြားချက်သည် Ct တန်ဖိုး ကြီးလွန်းခြင်း သို့မဟုတ် သေးငယ်လွန်းခြင်းတို့ ဖြစ်စေသည်။
4.Ct တန်ဖိုးသည် အလွန်ကြီးသည် သို့မဟုတ် သေးငယ်လွန်းသည်။
စာတိုက်အချိန်- ဖေဖော်ဝါရီ-၂၂-၂၀၂၃
