ပမာဏ PCR သို့မဟုတ် qPCR ဟုလည်းသိကြသော Real Time PCR သည် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းထုတ်ကုန်များ၏ အချိန်နှင့်တပြေးညီစောင့်ကြည့်ခြင်းနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက် နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။
quantitative PCR တွင် ရိုးရှင်းသော လုပ်ဆောင်ချက်၊ မြန်ဆန်ပြီး အဆင်ပြေမှု၊ မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်း၊ ထပ်တလဲလဲနိုင်မှုနှင့် ညစ်ညမ်းမှုနှုန်း နည်းပါးသောကြောင့်၊ ၎င်းအား ဆေးဘက်ဆိုင်ရာ စမ်းသပ်မှု၊ ဆေးဝါးထိရောက်မှု အကဲဖြတ်မှု၊ မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုဆိုင်ရာ သုတေသန၊ မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ သုတေသန၊ မျိုးဗီဇရှာဖွေမှု၊ ရောဂါပိုးရှာဖွေတွေ့ရှိမှု၊ တိရစ္ဆာန်နှင့် အပင်ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုတို့တွင် တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုပါသည်။အစားအစာစမ်းသပ်ခြင်းနှင့်အခြားနယ်ပယ်။
ထို့ကြောင့် သင်သည် အသက်မွေးဝမ်းကြောင်းသိပ္ပံတွင် အခြေခံသုတေသနတွင် ပါဝင်နေသည်ဖြစ်စေ၊ ဆေးဝါးကုမ္ပဏီများ၊ တိရစ္ဆာန်မွေးမြူရေးကုမ္ပဏီများ၊ စားသောက်ကုန်ကုမ္ပဏီများ၊ သို့မဟုတ် အဝင်-အထွက်စစ်ဆေးရေးနှင့် quarantine ဗျူရို၊ ပတ်ဝန်းကျင်စောင့်ကြည့်ရေးဌာနများ၊ ဆေးရုံများနှင့် အခြားယူနစ်များ၏ ဝန်ထမ်းများပင်ဖြစ်စေ သင်သည် ပမာဏနည်းသော PCR နှင့် ထိတွေ့ခွင့်ရရှိရန် လိုအပ်ပါသည်။

အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR ၏အခြေခံမူ

အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR သည် PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် fluorescent ဒြပ်စင်များကိုပေါင်းထည့်သည့်နည်းလမ်းဖြစ်ပြီး PCR တုံ့ပြန်မှုဖြစ်စဉ်တွင် fluorescence signal intensity ကို quantitative PCR တူရိယာဖြင့် အချိန်နှင့်တပြေးညီစောင့်ကြည့်ပြီး၊ နောက်ဆုံးတွင် စမ်းသပ်ဒေတာကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး စီမံဆောင်ရွက်ပါသည်။

【အသံချဲ့စက်မျဉ်းကွေး】PCR ၏ ဒိုင်းနမစ်ဖြစ်စဉ်ကို ဖော်ပြသည့်မျဉ်းကွေးဖြစ်သည်။PCR ၏ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးသည် အမှန်တကယ်တွင် စံကိန်းဂဏန်းမျဉ်းမဟုတ်သော်လည်း sigmoid မျဉ်းကွေးဖြစ်သည်။

[ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၏ ပလပ်ဖောင်းအဆင့်]PCR လည်ပတ်မှု အရေအတွက် တိုးလာခြင်း၊ DNA polymerase ၏ အသက်မဝင်ခြင်း၊ dNTPs များနှင့် primers များ လျော့နည်းလာခြင်းနှင့် ထုတ်ကုန် pyrophosphate တုံ့ပြန်မှုမှ ပေါင်းစပ်တုံ့ပြန်မှုကို ဟန့်တားခြင်း စသည်တို့ကြောင့် PCR သည် အမြဲတမ်း ချဲ့ထွင်ခြင်းမရှိပါ။ပြီးလျှင် နောက်ဆုံးတွင် ကုန်းပြင်မြင့်တစ်ခုသို့ ဝင်ရောက်မည်ဖြစ်သည်။

[Amplification Curve ၏ အဆပွားတိုးတက်မှု ဒေသ]ကုန်းပြင်မြင့်အဆင့်သည် အလွန်ကွဲပြားသော်လည်း၊ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၏ အဆတိုးနှုန်းဆိုင်ရာ ဒေသတစ်ခုတွင်၊ ထပ်တလဲလဲနိုင်မှုသည် အလွန်ကောင်းမွန်သည်၊ ၎င်းသည် PCR ၏ ပမာဏခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။

[အဆင့်သတ်မှတ်တန်ဖိုးနှင့် Ct တန်ဖိုး]ကျွန်ုပ်တို့သည် အတိုင်းအတာတန်ဖိုး (Threshold) ဟုခေါ်သော ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၏ ထပ်ကိန်းကြီးထွားမှုဧရိယာရှိ သင့်လျော်သောအနေအထားတွင် fluorescence သိရှိခြင်း၏ ကန့်သတ်တန်ဖိုးကို သတ်မှတ်သည်။threshold value နှင့် amplification curve သည် Ct value ဖြစ်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ Ct value သည် threshold value ကိုရောက်ရှိသောအခါ သံသရာအရေအတွက် (Threshold Cycle) ကို ရည်ညွှန်းပါသည်။

အောက်ဖော်ပြပါဂရပ်သည် threshold line နှင့် amplification curve၊ threshold နှင့် Ct တန်ဖိုးတို့ကြား ဆက်နွယ်မှုကို ရှင်းလင်းစွာပြသသည်။

【ဘယ်လိုရေတွက်ရမလဲ။】

Ct တန်ဖိုးသည် ကနဦးပုံစံပလိတ်အရေအတွက်၏ လော့ဂရစ်သမ်နှင့် ပြောင်းပြန်ဆက်နွယ်မှုရှိကြောင်း သင်္ချာသီအိုရီက သက်သေပြခဲ့သည်။အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR သည် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းဆိုင်ရာ ထုတ်ကုန်များကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ စောင့်ကြည့်စစ်ဆေးပြီး ချဲ့ထွင်မှုအဆင့်အတွင်း ၎င်းတို့ကို အရေအတွက်တိုင်းတာသည်။

PCR ၏စက်ဝန်းတစ်ခုစီအတွက်၊ DNA သည် အဆနှစ်ဆတိုးလာပြီး မကြာမီတွင် ကုန်းပြင်မြင့်သို့ရောက်ရှိခဲ့သည်။

စတင်သည့် DNA ပမာဏသည် A ဖြစ်သည်ဟု ယူဆပါသည်။₀ n လည်ပတ်ပြီးနောက်၊ သီအိုရီအရ DNA ထုတ်ကုန်၏ ပမာဏကို အောက်ပါအတိုင်း ဖော်ပြနိုင်သည်။

A _n =A ₀ ×၂ⁿ

ထို့နောက်၊ ကနဦး DNA ပမာဏ A 0 ပိုများလေ၊ ချဲ့ထွင်ထားသော ထုတ်ကုန်ပမာဏသည် ထောက်လှမ်းမှုတန်ဖိုး An သို့ ရောက်ရှိလေဖြစ်ပြီး An သို့ရောက်ရှိသည့်အခါ သံသရာအရေအတွက်သည် Ct တန်ဖိုးဖြစ်သည်။ဆိုလိုသည်မှာ၊ ကနဦး DNA ပမာဏ A 0 သည် ပိုများလေလေ၊ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး စောလေလေဖြစ်ပြီး၊ တူညီစွာ လိုအပ်သော သံသရာ n အရေအတွက်သည် သေးငယ်လေဖြစ်သည်။

ကျွန်ုပ်တို့သည် သိရှိထားသည့် အာရုံစူးစိုက်မှုစံနှုန်း၏ gradient ကို ဖျစ်ဖျော့ဖျော့လုပ်ဆောင်ပြီး ၎င်းကို Real Time PCR အတွက် နမူနာပုံစံတစ်ခုအနေဖြင့် အသုံးပြုကာ DNA ပမာဏကို များများမှ နည်းသွားစေရန်အတွက် တူညီသောအချိန်အပိုင်းအခြားအလိုက် ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးများကို ရရှိမည်ဖြစ်သည်။Ct တန်ဖိုး နှင့် စတင်သော တင်းပလိတ်များ အရေအတွက်၏ လော့ဂရစ်သမ်ကြား မျဉ်းကြောင်း ဆက်စပ်မှုအရ၊ a[စံမျဉ်းကွေး] ဖန်တီးနိုင်သည်။

နမူနာ၏ Ct တန်ဖိုးကို စံမျဉ်းကွေးသို့ အမည်မသိအာရုံစူးစိုက်မှုဖြင့် အစားထိုးခြင်းဖြင့်၊ အမည်မသိအာရုံစူးစိုက်မှုရှိသော နမူနာ၏ကနဦးပုံစံပမာဏကို Real Time PCR ၏ အရေအတွက်ဆိုင်ရာနိယာမဖြစ်သည့် ပမာဏကို ရရှိနိုင်သည်။

Real Time PCR ၏ထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်း

အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR သည် တုံ့ပြန်မှုစနစ်ရှိ fluorescence ပြင်းထန်မှုကို ရှာဖွေခြင်းဖြင့် PCR ချဲ့ထွင်မှုထုတ်ကုန်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိသည်။

ရောင်ရမ်း ဆိုးဆေး မြှုပ်နှံခြင်းဆိုင်ရာ သဘောတရား】

ချောင်းဆိုးဆေးTB Green ® ကဲ့သို့သော တီဘီရောဂါသည် PCR စနစ်များရှိ နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA နှင့် ချည်နှောင်မှုအပေါ်တွင် fluoresce လုပ်နိုင်သည် ။

PCR လည်ပတ်မှု တိုးလာသည်နှင့်အမျှ တုံ့ပြန်မှုစနစ်ရှိ အလင်းရောင်ပြင်းအားသည် အဆတိုးလာသည်။fluorescence ပြင်းထန်မှုကို ထောက်လှမ်းခြင်းဖြင့်၊ တုံ့ပြန်မှုစနစ်ရှိ DNA ချဲ့ထွင်မှုပမာဏကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ စောင့်ကြည့်နိုင်ပြီး၊ ထို့နောက် နမူနာရှိ စတင်သည့်ပုံစံ၏ ပမာဏကို ပြောင်းပြန်ခန့်မှန်းနိုင်ပါသည်။

【ချောင်းစူးစမ်းခြင်းနည်းလမ်း၏မူလ】

ချောင်းစူးစမ်းရေး5′ အဆုံးတွင် ချောင်းအုပ်စုနှင့် 3′ အဆုံးရှိ နျူကလိယအက်ဆစ် အစီအစဥ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး ပုံစံပလိတ်နှင့် အတိအကျ ချည်နှောင်နိုင်သည်။probe သည် နဂိုအတိုင်းဖြစ်သောအခါ၊ ဖလိုရိုဖရီမှ ထုတ်လွှတ်သော fluorescence သည် quenching group မှ မီးငြိမ်းသွားပြီး fluoresce မရနိုင်ပါ။စူးစမ်းလေ့လာမှု ပြိုကွဲသွားသောအခါ၊ အလင်းဓာတ်သည် ကွဲထွက်ပြီး fluorescence ကို ထုတ်လွှတ်မည်ဖြစ်သည်။

PCR တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်တွင် fluorescent probe ကို ထည့်သွင်းထားသည်။လိမ်းခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ fluorescent probe သည် ပုံစံပလိတ်၏ သီးခြားအနေအထားနှင့် ချိတ်ဆက်မည်ဖြစ်သည်။တိုးချဲ့မှုလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ PCR အင်ဇိုင်း၏ 5′→3′ exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်သည် ပုံစံပလိတ်နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော fluorescent probe ကို ပြိုကွဲစေပြီး fluorescent ဒြပ်စင်သည် fluorescence ကိုထုတ်လွှတ်ရန် ဆက်စပ်နေသည်။တုံ့ပြန်မှုစနစ်ရှိ probe ၏ fluorescence ပြင်းထန်မှုကို ထောက်လှမ်းခြင်းဖြင့်၊ PCR ထုတ်ကုန်၏ ချဲ့ထွင်မှုပမာဏကို စောင့်ကြည့်ခြင်း၏ ရည်ရွယ်ချက်ကို အောင်မြင်နိုင်သည်။

【Fluorescence Detection Method ကို ရွေးချယ်ခြင်း။】

SNP စာရိုက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကဲ့သို့ multiplex PCR ထောက်လှမ်းမှုကို မြင့်မားသောတူရိုးတူစိတ်ဖြင့် ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် အသုံးပြုပါက၊ fluorescent probe နည်းလမ်းကို အစားထိုး၍မရပါ။
အခြားအချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ ရိုးရှင်း၊ လွယ်ကူပြီး ကုန်ကျစရိတ်နည်းသော မီးချောင်းမီးချောင်းနည်းလမ်းကို အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။

စမ်းသပ်မှုအားကောင်းသောတိကျမှု၊ multiplex PCR ကိုလုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်း

ချို့ယွင်းချက်

အသံချဲ့စက်အတွက် အထူးသီးသန့်လိုအပ်ချက်များ၊

multiplex PCR မလုပ်ဆောင်နိုင်ပါ၊ တိကျသော probes များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ရန် လိုအပ်ပြီး၊ ကုန်ကျစရိတ် မြင့်မားခြင်း၊

တစ်ခါတစ်ရံတွင် probe design သည်ခက်ခဲသည်။

ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-