PCR, မျိုးစုံ PCR, PCR မှာ, PCR ပြောင်းပြန်, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

PCR အမျိုးမျိုး၏ သဘောတရားများ၊ အဆင့်များနှင့် အသေးစိတ်များကို ခွဲထုတ်ပါမည်။

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction သည် PCR ဟုရည်ညွှန်းသည် သည် သီးခြား DNA အပိုင်းအစများကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် အသုံးပြုသည့် မော်လီကျူး ဇီဝနည်းပညာတစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်းကို အထူး DNA ပွားခြင်းအဖြစ် vitro တွင် မှတ်ယူနိုင်ပါသည်။DNA Polymerase (DNA Polymerase I) ကို 1955 ခုနှစ်အစောပိုင်းတွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး စမ်းသပ်တန်ဖိုးနှင့် လက်တွေ့ကျသည့် Klenow Fragment of E. Coli ကို ဒေါက်တာ H. Klenow မှ 1970 ခုနှစ်များအစောပိုင်းတွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သော်လည်း၊ ဤအင်ဇိုင်းသည် အပူချိန်ကို ခံနိုင်ရည်မရှိသောကြောင့် မြင့်မားသောအပူချိန်သည် ၎င်းကို ပျက်ယွင်းစေနိုင်သောကြောင့် ၎င်းသည် မြင့်မားသော အပူချိန်တွင် ပေါ်လီမာဆက်တက်ခြင်းကွင်းဆက်တုံ့ပြန်မှုနှင့် မကိုက်ညီပါ။ယနေ့အသုံးပြုနေသော အင်ဇိုင်းများ (Taq polymerase) ကို 1976 ခုနှစ်တွင် ရေပူစမ်းဘက်တီးရီးယားဖြစ်သည့် Thermus aquaticus မှခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ ၎င်း၏လက္ခဏာမှာ မြင့်မားသောအပူချိန်ကို ခံနိုင်ရည်ရှိပြီး စံပြအင်ဇိုင်းတစ်ခုဖြစ်သော်လည်း ၎င်းကို 1980 ခုနှစ်များနောက်ပိုင်းတွင် တွင်ကျယ်စွာအသုံးပြုလာခြင်းဖြစ်သည်။PCR ၏မူရင်းပဏာမရှေ့ပြေးပုံစံ၏မူရင်းအယူအဆသည် 1971 ခုနှစ်တွင် ဒေါက်တာ KJell Kleppe မှအဆိုပြုခဲ့သော မျိုးရိုးဗီဇပြုပြင်ခြင်းနှင့် ကူးယူခြင်းနှင့်ဆင်တူသည်။ သူသည် ပထမဆုံးရိုးရှင်းသောနှင့်တိုတောင်းသောဗီဇကော်ပီကိုထုတ်ဝေခဲ့သည် (PCR ၏ပထမသံသရာတုံ့ပြန်မှုနှစ်ခုနှင့်ဆင်တူသည်)။ယနေ့တီထွင်ခဲ့သော PCR ကို 1983 ခုနှစ်တွင် ဒေါက်တာ Kary B. Mullis မှ တီထွင်ခဲ့သည်။ ဒေါက်တာ Mullis သည် ထိုနှစ်တွင် PE ကုမ္ပဏီများတွင် တာဝန်ထမ်းဆောင်ခဲ့သည်၊ ထို့ကြောင့် PE သည် PCR လုပ်ငန်းတွင် အထူးအဆင့်အတန်းတစ်ခုရှိသည်။ဒေါက်တာ Mullis သည် Saiki နှင့် အခြားသူများနှင့် ပထမဆုံးဆက်စပ်သော စာတမ်းကို 1985 ခုနှစ်တွင် တရားဝင်ထုတ်ဝေခဲ့သည်။ ထိုအချိန်မှစ၍ PCR အသုံးပြုမှုသည် တစ်ရက်လျှင် မိုင်ထောင်ချီရှိပြီး ဆက်စပ်စာရွက်များ၏ အရည်အသွေးသည် အခြားသော သုတေသနနည်းလမ်းများစွာကို အရသာမခံနိုင်ဟု ဆိုနိုင်ပါသည်။နောက်ပိုင်းတွင် PCR နည်းပညာကို ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနနှင့် လက်တွေ့အသုံးချမှုများတွင် တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုခဲ့ပြီး မော်လီကျူးဇီဝဗေဒ သုတေသန၏ အရေးကြီးဆုံးနည်းပညာဖြစ်လာသည်။Mullis သည် ၁၉၉၃ ခုနှစ် ဓာတုဗေဒ နိုဘယ်လ်ဆုကိုလည်း ရရှိခဲ့သည်။

PCRစာမူ

PCR နည်းပညာ၏အခြေခံနိယာမသည် DNA ၏သဘာဝပုံတူပွားမှုဖြစ်စဉ်နှင့်ဆင်တူပြီး၎င်း၏တိကျမှုမှာပစ်မှတ်အစီအစဥ်၏အစွန်းနှစ်ဖက်စလုံးနှင့်ဖြည့်စွက်ထားသည့် oligonucleotide primer ပေါ်တွင်မူတည်သည်။PCR သည် degeneration-annealing-extending အဆင့်သုံးဆင့်ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည်- ① template DNA ၏ ယိုယွင်းမှု- template DNA ကို အချိန်အတိုင်းအတာတစ်ခုအထိ 93°C ခန့် အပူပေးပြီးနောက်၊ Dual-chain DNA အတွက် ဖြေရှင်းချက် Dual-chain DNA အတွက် ဖြေရှင်းချက် PCR ၏ ချဲ့ထွင်မှုဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော PCR မှ ခွဲထွက်ခြင်း template ၏ DNA ကို ချဲ့ထွင်ခြင်းဖြင့် နောက်ထပ်တုံ့ပြန်မှုအတွက် ကွင်းဆက်တစ်ခုတည်းဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ပါ။② ပုံစံပလိတ် DNA နှင့် primer ၏ ဖြာထွက်မှု (ဒြပ်ပေါင်း)- နမူနာပုံစံ DNA ကို အပူပေးပြီး ကွင်းဆက်တစ်ခုတည်းအဖြစ် ပျက်ယွင်းပြီးနောက်၊ အပူချိန်သည် 55°C ခန့်သို့ ကျဆင်းသွားသည်။primer နှင့် template DNA single-chain ၏ ဖြည့်စွက်စာ။③ primer ၏တိုးချဲ့မှု- DNA ပုံစံ- primer binding သည် dNTP ၏တုံ့ပြန်မှုကုန်ကြမ်းအဖြစ် TaqDNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်ချက်အပေါ်အခြေခံသည်။ပုံစံတူ DNA ကွင်းဆက်ကို အားဖြည့်ပေးသည့် တစ်ပိုင်းသီးသန့် ကူးယူထားသော ကွင်းဆက်အသစ်ကို ပေါင်းစပ်ပြီး သံသရာယိုယွင်းခြင်း- annealing-extension လုပ်ငန်းစဉ်သုံးရပ်ကို ထပ်ခါထပ်ခါ ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် "တစ်ပိုင်းသီးသန့် မိတ္တူကွင်းဆက်" ကို ထပ်မံရရှိနိုင်ပြီး ဤကွင်းဆက်အသစ်သည် နောက်သံသရာအတွက် နမူနာပုံစံတစ်ခု ဖြစ်လာပြန်သည်။ကွင်းဆက်ပြီးမြောက်ရန် 2-4 မိနစ်ကြာသည်၊ ပစ်မှတ်ဗီဇကို 2-3 နာရီအတွင်း အကြိမ်ပေါင်း သန်းပေါင်းများစွာ ချဲ့နိုင်သည်။

စံPCRတုံ့ပြန်မှုစနစ်

PCR တုံ့ပြန်မှု၏ဒြပ်စင်ငါးခု

PCR တုံ့ပြန်မှုတွင် အဓိကအားဖြင့် ပါဝင်သည့် အရာငါးမျိုးမှာ primer၊ enzyme၊ dNTP၊ template နှင့် buffer (Mg2+ လိုအပ်သည်)။[PCR လုပ်ထုံးလုပ်နည်း]

စံ PCR လုပ်ငန်းစဉ်ကို အဆင့်သုံးဆင့်ခွဲထားသည်။

1. DNA ယိုယွင်းခြင်း (90°C-96°C)- အပူလုပ်ဆောင်ချက်အောက်ရှိ Dual-chain DNA နမူနာများ၊ ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများ ကွဲထွက်ပြီး ကွင်းဆက် DNA တစ်ခုတည်းအဖြစ် ဖြစ်ပေါ်လာသည်။

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): စနစ်အပူချိန်ကို လျှော့ချလိုက်ပြီး၊ primer ကို ဒေသခံ dual-chain တစ်ခုအဖြစ် DNA ပုံစံဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။

3. တိုးချဲ့မှု (70 ℃ -75 ℃): Taq အင်ဇိုင်း (72°C ခန့်၊ အကောင်းဆုံးလုပ်ဆောင်မှု) အောက်တွင် dNTP ကို ​​ကုန်ကြမ်းအဖြစ်အသုံးပြုသည်၊ primer ၏ 5′ အဆုံး → 3′ အဆုံးအထိ၊ ပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် ပုံစံပလိတ်သည် တစ်ခုနှင့်တစ်ခု DNA ကွင်းဆက်ကို အားဖြည့်ပေးသည်။

သံသရာတစ်ခုစီသည် DNA ပါဝင်မှုကို နှစ်ဆတိုးစေပြီး၊ ဖယ်ထုတ်ပြီး ချဲ့ထွင်သည်။လက်ရှိတွင်၊ တိုတောင်းသောချဲ့ထွင်မှုဧရိယာကြောင့် Taq အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်သည် အကောင်းဆုံးမဟုတ်သော်လည်း အချိန်တိုအတွင်း ပုံတူပွားနိုင်ပြီး၊ ထို့ကြောင့် ၎င်းကို အဆင့်နှစ်ဆင့်သို့ ပြောင်းလဲနိုင်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ အပူချိန် 60°C-65°C တွင် တစ်ချိန်တည်းတွင် လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။ရုတ်သိမ်းခြင်းနှင့် အအေးပေးခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို လျှော့ချရန်နှင့် တုံ့ပြန်မှုအရှိန်ကို မြှင့်တင်ရန်။

PCR တုံ့ပြန်မှုအင်္ဂါရပ်များ

● High-Specificity

PCR တုံ့ပြန်မှု၏ သီးခြားပြတ်သားသောအချက်များမှာ- ① primer နှင့် template DNA ၏ သီးခြားပေါင်းစပ်မှု။② အခြေခံတွဲခြင်း၏နိယာမ။③ TaqDNA polymerase ပေါင်းစပ်တုံ့ပြန်မှု၏သစ္စာစောင့်သိမှု။④ ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ တိကျမှုနှင့် ရှေးရိုးစွဲမှု။

primers နှင့် template များ မှန်ကန်သောပေါင်းစပ်မှုသည် အဓိကဖြစ်သည်။primer နှင့် template နှင့် primer chain ၏ extension တို့သည် alkaline base matching နိယာမအပေါ် အခြေခံထားသည်။ပလိတ်နှင့် primer ၏ ပေါင်းစပ်မှု (ဒြပ်ပေါင်း) ကို တုံ့ပြန်မှုတွင် ပိုမိုမြင့်မားသော အပူချိန်တွင် လုပ်ဆောင်နိုင်စေရန်အတွက် Polymerase ပေါင်းစပ်တုံ့ပြန်မှုများနှင့် Taq DNA polymerase ၏ မြင့်မားသော အပူချိန်ခံနိုင်ရည်ရှိမှု။ပေါင်းစပ်မှု၏ထူးခြားချက်သည်အလွန်တိုးလာသည်။ကလစ်သည် မှန်ကန်မှုအဆင့်ကို ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည်။မြင့်မားသော ရှေးရိုးဆန်မှုနှင့် ရှေးရိုးဆန်မှု မြင့်မားသော ပစ်မှတ်မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ ဒေသကို ရွေးချယ်ခြင်းဖြင့် ၎င်း၏ တိကျမှုမှာ ပိုမိုမြင့်မားသည်။

● အာရုံခံနိုင်စွမ်း မြင့်မားခြင်း။

PCR ထုတ်ကုန်များ၏ ထုတ်လုပ်မှုပမာဏသည် မိုက်ခရိုဂရမ်အဆင့် (μg= -6) အဆင့်အထိ တိုးမြှင့်ရန်အတွက် မိုက်ခရိုကွန်ထရိုလာအဆင့်ကို မိုက်ခရိုဂရမ်အဆင့်အထိ တိုးမြှင့်နိုင်စေမည့် Picker (PG=10-12) ၏ အစပုံစံပုံစံ (PG=10-12) ကို ချဲ့ထွင်နိုင်သည်။ပစ်မှတ်ဆဲလ်များကို ဆဲလ် ၁ သန်းမှ ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်။ဗိုင်းရပ်စ်များကို ထောက်လှမ်းရာတွင် PCR ၏ အာရုံခံနိုင်စွမ်းသည် RFU 3 ခု (ဗလာကျင်းထားသော ယူနစ်များ) သို့ ရောက်ရှိနိုင်သည်။ဘက်တီးရီးယား သိပ္ပံတွင် အနိမ့်ဆုံး ထောက်လှမ်းမှုနှုန်းမှာ ဘက်တီးရီးယား ၃ မျိုးဖြစ်သည်။

● ရိုးရှင်းပြီး မြန်ဆန်သည်။

PCR ရောင်ပြန်ဟပ်မှုတွင် အပူချိန်မြင့်မားသော Taq DNA polymerase ကို အသုံးပြုထားပြီး၊ ဆိုလိုသည်မှာ DNA ချဲ့ထွင်မှုဖြေရှင်းချက်နှင့် ရေချိုးအိုးပေါ်ရှိ ယိုယွင်းမှု- anneal-extension တုံ့ပြန်မှုဖြစ်သည့် တစ်ချိန်တည်းတွင် တုံ့ပြန်မှုအဖြေကို ပေါင်းထည့်သည်။ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှုသည် ၂ နာရီမှ ၄ နာရီအတွင်း ပြီးမြောက်သည်။တိုးမြှင့်ထားသော ထုတ်ကုန်များကို ယေဘူယျအားဖြင့် လျှပ်စစ်ဓားဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး အိုင်ဆိုတုပ်များကို အသုံးပြုရန် မလိုအပ်ဘဲ ရေဒီယိုသတ္တိကြွ ညစ်ညမ်းမှု မရှိစေဘဲ လွယ်ကူစွာ မြှင့်တင်ပေးပါသည်။

● နမူနာ၏ သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှု နည်းပါးသည်။

ဗိုင်းရပ်စ်များ သို့မဟုတ် ဘက်တီးရီးယားများနှင့် ယဉ်ကျေးမှုဆဲလ်များကို ခွဲခြားရန်မလိုအပ်ပါ။DNA အရိုင်းထုတ်ကုန်များနှင့် RNA ကို အသံချဲ့စက်အဖြစ် အသုံးပြုနိုင်သည်။သွေး၊ ခန္ဓာကိုယ်အရည်၊ ချောင်းဆိုးဆေးရည်၊ ဆံပင်၊ ဆဲလ်များနှင့် သက်ရှိတစ်ရှူးစသည့် လက်တွေ့နမူနာများကို အသုံးပြု၍ DNA ချဲ့ထွင်ခြင်းအား ထောက်လှမ်းခြင်းအား တိုက်ရိုက်အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။

PCRအဖြစ်များသောပြဿနာများ

● မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာ၊ ချဲ့ထွင်ထားသော တီးဝိုင်းများ မရှိပါ။

PCR တုံ့ပြန်မှု၏အဓိကအဆင့်များပါဝင်သည်- ① နမူနာပုံစံနယူကလိယအက်ဆစ်များပြင်ဆင်မှု၊ ② အရည်အသွေးနှင့် primers များ၏တိကျမှု၊ ③ အင်ဇိုင်းများ၏အရည်အသွေး ④ PCR လည်ပတ်မှုအခြေအနေများ။အကြောင်းရင်းကို ရှာဖွေရာတွင်လည်း အထက်ဖော်ပြပါ လင့်ခ်များအတွက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာလေ့လာသင့်ပါသည်။

နမူနာပုံစံများ- ① ပုံစံပြားတွင် အမျိုးမျိုးသော ပရိုတင်းများ ပါ၀င်သည်၊ ② နမူနာပုံစံတွင် Taq အင်ဇိုင်း တားဆေးပါရှိသည်၊ ③ ပုံစံပလိတ်ရှိ ပရိုတင်းကို မဖယ်ရှားပါ၊ အထူးသဖြင့် ခရိုမိုဆုန်းရှိ အုပ်စုပရိုတင်းများ။⑤ Deminer nucleic acid ယိုယွင်းမှုသည် စေ့စေ့စပ်စပ်မဖြစ်ပါ။အင်ဇိုင်းများနှင့် primers များ၏အရည်အသွေးကောင်းမွန်သောအခါ၊ နမူနာများ၏အစာခြေခြင်းကိုကုသရန်အများဆုံးဖြစ်နိုင်သော amplification band မရှိပါ။နမူနာပုံစံ nucleic acid ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တွင် တစ်ခုခုမှားယွင်းနေသောကြောင့် ထိရောက်ပြီး တည်ငြိမ်သောအစာခြေခြင်းဖြေရှင်းချက်ကို ပြင်ဆင်ရန်အတွက် ၎င်း၏လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို ပြင်ဆင်ပြီး မထင်သလိုမပြောင်းလဲသင့်ပါ။

အင်ဇိုင်းမလှုပ်ရှားခြင်း- အင်ဇိုင်းအသစ် သို့မဟုတ် အင်ဇိုင်းအဟောင်းနှင့် အင်ဇိုင်းအသစ် နှစ်မျိုးလုံးကို အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက် ဆုံးရှုံးခြင်း သို့မဟုတ် မလုံလောက်ခြင်း ရှိ၊မရှိ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်၊ မှားယွင်းသောအနုတ်လက္ခဏာများဆီသို့ ဦးတည်စေပါသည်။Taq အင်ဇိုင်း သို့မဟုတ် ethidium bromide သည် တစ်ခါတစ်ရံ မေ့လျော့သွားကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။

Primer- primer ၏ အရည်အသွေး၊ primer ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် primer နှစ်ခု၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် အချိုးညီမှုရှိမရှိ၊PCR ချို့ယွင်းမှု သို့မဟုတ် တိုးလာနေသော တီးဝိုင်းသည် စံပြမဟုတ်ပဲ ပျံ့နှံ့လွယ်သော အကြောင်းရင်းတစ်ခုဖြစ်သည်။အသုတ်နံပါတ်အချို့၏ primer များ၏အရည်အသွေးနှင့်ပြဿနာများရှိသည်။Primers နှစ်ခုတွင် မြင့်မားသော အာရုံစူးစိုက်မှုရှိပြီး အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသော စွမ်းဆောင်ရည်နိမ့်သော အချိုးမညီသော ချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်စေသည်။တန်ပြန်ဆောင်ရွက်မှုများမှာ- ① ယူနစ်များပေါင်းစပ်ရန် ကောင်းသော primer ကိုရွေးချယ်ပါ။② primer ၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည် OD တန်ဖိုးပေါ်တွင်မူတည်သည်သာမက agar သကြားဂျယ် electrophoresis ပြုလုပ်ရန် primer ၏မူလအရည်ကိုလည်းအာရုံစိုက်သည်။primer strip zone တစ်ခုရှိရမည်ဖြစ်ပြီး primer နှစ်ခု၏တောက်ပမှုသည်ယေဘုယျအားဖြင့်တသမတ်တည်းဖြစ်သင့်သည်။ခါးပတ်၊ PCR သည် ဤအချိန်တွင် ကျရှုံးနိုင်သည်၊ ၎င်းကို primer ပေါင်းစပ်ယူနစ်ဖြင့် ဖြေရှင်းသင့်သည်။Primer မြင့်မားပါက တောက်ပမှုနည်းပြီး ၎င်း၏အာရုံစူးစိုက်မှုကို ရောနှောနေချိန်တွင် မျှတရပါမည်။③ ရေခဲသေတ္တာ၏ အေးခဲခြင်း သို့မဟုတ် ကြာရှည်စွာ အအေးပေးထားသည့် အစိတ်အပိုင်းများစွာကို ကာကွယ်ရန် primer ကို မြင့်မားစွာ ပေးချေပြီး သိမ်းဆည်းထားသင့်ပြီး Primer ကို ယိုယွင်းပျက်စီးသွားစေမည့် ၊④ primer ၏အရှည်မလုံလောက်သကဲ့သို့ primer ၏ဒီဇိုင်းသည်ယုတ္တိမရှိပါ၊ နှင့် di cluster ကို primers များကြားတွင်ဖွဲ့စည်းထားသည်။

Mg2+ အာရုံစူးစိုက်မှု- Mg2+ ion အာရုံစူးစိုက်မှုသည် PCR ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုအပေါ် ကြီးမားသောသက်ရောက်မှုရှိသည်။အလွန်အကျွံအာရုံစူးစိုက်မှုသည် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်း၏ဆန့်ကျင်ဘက်လိင်ကိုလျှော့ချနိုင်သည်။အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းလွန်းပါက၊ PCR ချဲ့ထွင်မှုအထွက်သည် တိုးချဲ့တီးမှုတ်ခြင်းမရှိဘဲ PCR ချဲ့ထွင်မှုကိုပင် ပျက်ကွက်စေသည်။

တုံ့ပြန်မှုပမာဏ ပြောင်းလဲခြင်း- PCR ချဲ့ထွင်မှုတွင် အသုံးပြုသည့် ပမာဏသည် 20ul၊ 30ul၊ နှင့် 50ul သို့မဟုတ် 100uL ဖြစ်ပြီး၊ PCR ချဲ့ထွင်မှုအတွက် အပလီကေးရှင်း၏ ထုထည်ကြီးမားမှုကို သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနနှင့် လက်တွေ့စမ်းသပ်ခြင်း၏ ရည်ရွယ်ချက်များအလိုက် သတ်မှတ်ထားသည်။20ul ကဲ့သို့သော သေးငယ်သော volumes ကိုပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ အရွယ်အစားပြုလုပ်ရာတွင် ကြိုးအခြေအနေတစ်ခုပြုလုပ်ရန် လိုအပ်သည်၊ သို့မဟုတ်ပါက ၎င်းသည် ပျက်သွားမည်ဖြစ်သည်။

ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ အကြောင်းရင်းများ- အသွင်ပြောင်းခြင်းသည် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းအတွက် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ယိုယွင်းမှု အပူချိန် နိမ့်ပါက ယိုယွင်းမှု အချိန်တိုသည် မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာများ ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်ဖွယ်ရှိသည်။အလွန်နိမ့်သော annealing အပူချိန်သည် အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို ဖြစ်စေနိုင်ပြီး တိကျသော အသံချဲ့စက်စွမ်းဆောင်ရည်ကို လျှော့ချနိုင်သည်။PCR ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှုကို လျှော့ချရန် primers နှင့် template များ ပေါင်းစပ်မှုကို လွန်စွာထိခိုက်စေပါသည်။တစ်ခါတစ်ရံတွင် PCR ၏ပျက်ကွက်မှု၏အကြောင်းရင်းတစ်ခုဖြစ်သည့် extension သို့မဟုတ် water-soluble cooker တွင်ကွဲပြားမှု၊ ပျော့ပျောင်းမှုနှင့်တိုးချဲ့ထားသောအပူချိန်ကိုရှာဖွေရန်စံသာမိုမီတာများကိုအသုံးပြုရန်လိုအပ်သည်။

ပစ်မှတ် sequence မျိုးကွဲများ- ပစ်မှတ် sequence ဖြစ်ပေါ်လာပါက၊ mutation သို့မဟုတ် deletion၊ prototype နှင့် template ၏ပေါင်းစပ်မှုကို ပေါင်းစပ်ထားသည် သို့မဟုတ် target sequence မရှိခြင်းကြောင့်၊ primer နှင့် template သည် complementary sequence ဆုံးရှုံးသွားမည်ဖြစ်ပြီး ၎င်း၏ PCR ချဲ့ထွင်မှုမှာ အောင်မြင်မည်မဟုတ်ပါ။

● မှားလာတာ

PCR amplification band သည် target sequence band နှင့် ကိုက်ညီနေပုံရပြီး တစ်ခါတစ်ရံ ၎င်း၏ band သည် ပိုသပ်ရပ်ပြီး ပိုမြင့်သည်။

Primer ဒီဇိုင်းသည် မသင့်လျော်ပါ- ရွေးချယ်ထားသော ချဲ့ထွင်မှုအစီအစဥ်နှင့် ရည်ရွယ်ချက်မဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုအစီအစဉ်တို့သည် တူညီသည်၊ ထို့ကြောင့် PCR ချဲ့ထွင်သည့်အခါ၊ ချဲ့ထွင်ထားသော PCR ထုတ်ကုန်များသည် ရည်ရွယ်ချက်မရှိသော ဆက်တိုက်များဖြစ်သည်။ပစ်မှတ် sequence တိုလွန်းသည် သို့မဟုတ် primer တိုလွန်းသည်၊ ၎င်းသည် false positive ဖြစ်နိုင်သည်။ပြန်လည် ဒီဇိုင်းရေးဆွဲရန် လိုအပ်ပါသည်။

ပစ်မှတ်အစီအစဥ် သို့မဟုတ် ချဲ့ထွင်ခြင်းထုတ်ကုန်များ၏ ဖြတ်ကျော်ညစ်ညမ်းမှု- ဤညစ်ညမ်းမှုအတွက် အကြောင်းရင်းနှစ်ခုရှိသည်- ပထမ၊ ဂျီနိုမ်တစ်ခုလုံး သို့မဟုတ် ကြီးမားသောအပိုင်းများကို ဖြတ်ကျော်ကာ မှားယွင်းသောအပြုသဘောများဖြစ်ပေါ်စေသည်။ဤအတုအယောင်အပြုသဘောမျိုးအား အောက်ပါနည်းလမ်းများဖြင့် ဖြေရှင်းနိုင်သည်- ပစ်မှတ်ကို နမူနာသေနတ်ထဲသို့ ရှူသွင်းခြင်း သို့မဟုတ် centrifugal tube မှ လွင့်ထွက်ခြင်းတို့ကို တားဆီးရန် စစ်ဆင်ရေးအတွင်း သတိနှင့် ညင်သာစွာ သတိထားပါ။မြင့်မားသောအပူချိန်ကို ခံနိုင်ရည်မရှိသော အင်ဇိုင်းများနှင့် ပစ္စည်းများမှလွဲ၍၊ ဓာတ်ပစ္စည်းများ သို့မဟုတ် ပစ္စည်းအားလုံးကို မြင့်မားသောဖိအားဖြင့် ပိုးသတ်သင့်သည်။centrifugal ပိုက်များနှင့် နမူနာများကို တစ်ကြိမ်တည်း အသုံးပြုသင့်သည်။လိုအပ်သောအခါ၊ နမူနာများမထည့်မီ၊ ရှိပြီးသား nucleic acid ကို ဖျက်ဆီးရန် ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်နှင့် တုံ့ပြန်မှုပြွန်နှင့် ဓါတ်ပစ္စည်းများကို ထိတွေ့သည်။ဒုတိယအချက်မှာ လေထုညစ်ညမ်းမှု အပိုင်းအစလေးများ။ဤအပိုင်းအစလေးများသည် ပစ်မှတ်အစီအစဥ်ထက် ပိုတိုသော်လည်း ၎င်းတို့တွင် တူညီမှုအချို့ရှိသည်။တစ်ခုနဲ့တစ်ခု ပေါင်းလို့ရပါတယ်။primers များကိုဖြည့်စွက်ပြီးနောက် PCR ထုတ်ကုန်ကိုချဲ့ထွင်နိုင်ပြီး၊ မှားယွင်းသောအပြုသဘောဆောင်သောထုတ်လုပ်မှုကိုဖြစ်စေသည်။အသိုက် PCR နည်းလမ်းကို လျှော့ချရန် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားရန် ၎င်းကို အသုံးပြုနိုင်သည်။

● အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်တီးဝိုင်းကို ပေါ်လာသည်။

PCR ချဲ့ထွင်မှုပြီးနောက် ပေါ်လာသည့် တီးဝိုင်းများသည် မျှော်လင့်ထားသည့် အရွယ်အစား သို့မဟုတ် ကြီးမားသည် သို့မဟုတ် သေးငယ်သည် သို့မဟုတ် တစ်ချိန်တည်းတွင်၊ သို့မဟုတ် တစ်ချိန်တည်းတွင်၊ တိကျသော အသံချဲ့စက်တီးဝိုင်းများနှင့် အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်လှိုင်းများနှင့် မကိုက်ညီပါ။အတိအကျမဟုတ်သော တီးဝိုင်းများ ပေါ်ပေါက်လာရခြင်းမှာ- ပထမဦးစွာ၊ primer များသည် target sequence နှင့် မပြည့်စုံသော၊ သို့မဟုတ် di cluster တစ်ခုအဖြစ် primer ၏ ပိုလီမာပြုလုပ်ခြင်း ဖြစ်သည်။ဒုတိယအချက်မှာ MG2+ အိုင်းယွန်းများ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် မြင့်မားလွန်းသည်၊ ဖြာထွက်သည့် အပူချိန်မှာ အလွန်နည်းနေပြီး PCR လည်ပတ်မှု အရေအတွက်နှင့် ဆက်စပ်နေသည်။နောက်တစ်ချက်ကတော့ အင်ဇိုင်းတွေရဲ့ အရည်အသွေးနဲ့ ပမာဏပါ။မကြာခဏဆိုသလို၊ အချို့သောရင်းမြစ်များ၏ အင်ဇိုင်းများသည် အထူးမဟုတ်သော ကြိုးဝိုင်းများဆီသို့ ကျရောက်တတ်ပြီး အခြားအရင်းအမြစ်များ၏ အင်ဇိုင်းများသည် ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းမရှိပါ။တခါတရံတွင် အတိအကျမဟုတ်သော အင်ဇိုင်းများ ချဲ့ထွင်ခြင်းလည်း ဖြစ်ပေါ်ပါသည်။တန်ပြန်ဆောင်ရွက်ချက်များမှာ- လိုအပ်ပါက ပြန်လည်ဒီဇိုင်းဆွဲခြင်း။အင်ဇိုင်းပမာဏကို လျှော့ချပါ သို့မဟုတ် အခြားအရင်းအမြစ်တစ်ခု၏ အင်ဇိုင်းကို အစားထိုးပါ။ပင်မပမာဏကို လျှော့ချပါ၊ တင်းပလိတ်များ၏ ပမာဏကို သင့်လျော်သလို တိုးမြှင့်ကာ သံသရာအရေအတွက်ကို လျှော့ချပါ။ဖြာထွက်သည့်အပူချိန်ကို မှန်ကန်စွာတိုးမြှင့်ပါ သို့မဟုတ် အပူချိန်အမှတ်နည်းလမ်းနှစ်ခု (၉၃ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ် ယိုယွင်းခြင်း၊ နှိမ့်ချခြင်းနှင့် ၆၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်ခန့်တွင် တိုးချဲ့ခြင်း) ကို အသုံးပြုပါ။

● မမြဲသောတွဲဆွဲ သို့မဟုတ် လိမ်းကျံထားသောတိပ်များပေါ်လာသည်။

PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းကို တစ်ခါတစ်ရံတွင် အသုံးချခြင်း သို့မဟုတ် အခွံခွာခြင်း သို့မဟုတ် ကော်ဇောကဲ့သို့သော ခါးပတ်ကို အသုံးပြုထားပုံရသည်။အကြောင်းရင်းမှာ အင်ဇိုင်းများ အလွန်အကျွံပမာဏ သို့မဟုတ် အင်ဇိုင်း၏ အရည်အသွေးညံ့ဖျင်းမှုကြောင့် dNTP အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားလွန်းခြင်း၊ Mg2+ အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားလွန်းခြင်း၊ annealing temperature နိမ့်လွန်းပြီး သံသရာအရေအတွက် များလွန်းသည်။တန်ပြန်ဆောင်ရွက်မှုများမှာ- ①အင်ဇိုင်းပမာဏကို လျှော့ချခြင်း၊ သို့မဟုတ် အခြားအရင်းအမြစ်တစ်ခု၏ အင်ဇိုင်းကို ပြောင်းလဲခြင်း။② dNTP ၏အာရုံစူးစိုက်မှုကို လျှော့ချပါ ③ Mg2+ အာရုံစူးစိုက်မှုကို မှန်ကန်စွာ လျှော့ချပါ။④ ပုံစံပလိတ်များ အရေအတွက်ကို တိုးမြှင့်ပြီး သံသရာ အရေအတွက်ကို လျှော့ချပါ။

ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ

PCR Heroᵀᴹ (ဆိုးဆေးပါသော)

◮ ပိုမြင့်သောသစ္စာရှိမှု- သာမန် Taq အင်ဇိုင်းထက် ၆ ဆ၊

◮ ပိုမိုမြန်ဆန်သော အသံချဲ့စက်အမြန်နှုန်း

◮ နောက်ထပ် ပုံစံခွက် လိုက်လျောညီထွေရှိမှု

◮ ပိုမိုမြင့်မားသော အသံချဲ့စက် စွမ်းဆောင်ရည်

◮ ပတ်ဝန်ကျင်ခံနိုင်ရည်သည် ပိုမိုအားကောင်းသည်- 37°C တွင် တစ်ပတ်ကြာ ထားရှိပြီး လှုပ်ရှားမှု 90% ကျော်ကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။

◮ ၎င်းတွင် 5'→3' DNA polymerase လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် 3'→5' exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်မပါဘဲ 5'→3' exonuclease လုပ်ဆောင်ချက် ပါရှိပါသည်။

PCR Easyᵀᴹ (ဆိုးဆေးပါသော)

ထူးခြားသောတုံ့ပြန်မှုစနစ်နှင့် စွမ်းဆောင်ရည်မြင့်မားသော Taq DNA Polymerase သည် PCR တုံ့ပြန်မှုကို ပိုမိုချဲ့ထွင်နိုင်စွမ်း၊ တိကျမှုနှင့် အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို ပိုမိုမြင့်မားစေသည်။

RT-qPCR Easyᵀᴹ (အဆင့်တစ်ဆင့်)-SYBR Green I

◮ အဆင့်တစ်ဆင့်သုံးကိရိယာသည် ပြောင်းပြန်စာသားမှတ်တမ်းနှင့် qPCR တူညီသောပြွန်အတွင်း တုံ့ပြန်မှုနှစ်ခုကို ပြုလုပ်ပေးသည်၊၊ ပုံစံပလိတ် RNA၊ သီးခြား PCR primers နှင့် RNase-Free ddH တို့ကိုသာ ထည့်သွင်းရန်လိုအပ်ပါသည်။₂O.

◮ အဆိုပါကိရိယာသည် ဗိုင်းရပ်စ် RNA သို့မဟုတ် ခြေရာခံ RNA ကို လျင်မြန်ထိရောက်စွာ ပမာဏခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်သည်။

◮ အဆိုပါကိရိယာသည် ထူးခြားသော Foregene ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း ဓါတ်ဆားနှင့် Foregene HotStar Taq DNA Polymerase နှင့် တုံ့ပြန်မှုစနစ်၏ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုနှင့် တိကျမှုတို့ကို ထိထိရောက်ရောက် မြှင့်တင်ရန်အတွက် အသုံးပြုပါသည်။

◮ ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ထားသော တုံ့ပြန်မှုစနစ်သည် တုံ့ပြန်မှုအား ပိုမိုမြင့်မားသောသိရှိနိုင်မှုအာရုံခံနိုင်စွမ်း၊ ပိုမိုအားကောင်းသောအပူတည်ငြိမ်မှုနှင့် ပိုမိုကောင်းမွန်သောခံနိုင်ရည်ရှိစေသည်။

◮ RT-qPCR လွယ်ကူသည်။^TM(အဆင့်တစ်ဆင့်)-SYBR Green I အစုံတွင် ROX အတွင်းပိုင်းရည်ညွှန်းဆိုးဆေးပါရှိပြီး၊ ရေတွင်းများကြားတွင် အချက်ပြနောက်ခံနှင့် အချက်ပြအမှားများကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် အသုံးပြုသူများအနေဖြင့် အရေအတွက် PCR တူရိယာမော်ဒယ်အမျိုးမျိုးတွင် အသုံးပြုရအဆင်ပြေစေမည့် သုံးစွဲသူများအတွက် အဆင်ပြေစေပါသည်။

RT အလွယ်^TMII (Master Premix for ပထမတန်း cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက်အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR)

- ပုံစံခွက်အတွင်းရှိ gDNA ကို ၂ မိနစ်အတွင်း ဖယ်ရှားနိုင်သည့် gDNA ကို ထိရောက်စွာ ဖယ်ရှားနိုင်သည်။

- ထိရောက်သော ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းစနစ်၊ ပထမကြိုးမျှင် cDNA ၏ပေါင်းစပ်မှုကို အပြီးသတ်ရန် 15 မိနစ်သာ ကြာပါသည်။

-Complex templates- မြင့်မားသော GC အကြောင်းအရာများနှင့် ရှုပ်ထွေးသော ဆင့်ပွားတည်ဆောက်ပုံပါရှိသော တင်းပလိတ်များကို စွမ်းဆောင်ရည်မြင့်မားစွာဖြင့် ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်သည်။

-High-sensitivity reverse transcription system၊ pg-level templates များသည် အရည်အသွေးမြင့် cDNA ကိုရနိုင်သည်။

- ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းစနစ်သည် မြင့်မားသောအပူတည်ငြိမ်မှုရှိပြီး အကောင်းဆုံးတုံ့ပြန်မှုအပူချိန်မှာ 42 ℃ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် 50 ℃တွင် ကောင်းမွန်သောပြောင်းပြန်စာသားမှတ်တမ်းစွမ်းဆောင်ရည်ရှိနေဆဲဖြစ်သည်။