PCR (polymerase ကွင်းဆက်တုံ့ပြန်မှု) သည် နှစ်ပေါင်း 30 ကျော်သမိုင်းနှင့်အတူ in-vitro DNA ချဲ့ထွင်မှုနည်းပညာများထဲမှတစ်ခုဖြစ်သည်။

PCR နည်းပညာကို 1983 ခုနှစ်တွင် USA, Cetus မှ Kary Mullis မှ ရှေ့ဆောင်ခဲ့သည်။ Mullis သည် PCR မူပိုင်ခွင့်အတွက် 1985 ခုနှစ်တွင် လျှောက်ထားခဲ့ပြီး ထိုနှစ်တွင် သိပ္ပံဆိုင်ရာ ပထမဆုံး PCR ပညာရပ်ဆိုင်ရာစာတမ်းကို ထုတ်ဝေခဲ့သည်။Mullis သည် ၎င်း၏ လက်ရာအတွက် 1993 ခုနှစ်တွင် ဓာတုဗေဒ နိုဘယ်ဆု ချီးမြှင့်ခံခဲ့ရသည်။

PCR ၏အခြေခံမူများ

PCR သည် ပစ်မှတ် DNA အပိုင်းအစများကို အကြိမ်တစ်သန်းထက်ပို၍ ချဲ့နိုင်သည်။နိယာမသည် တိုးချဲ့မှုအတွက် အစမှတ်အဖြစ် မိဘကြိုးမျှင် DNA နှင့် သီးခြား primer အဖြစ် အသုံးပြု၍ DNA polymerase ၏ ဓာတ်ပြုမှုအောက်တွင် ဖြစ်သည်။၎င်းကို denaturation၊ annealing နှင့် extension များကဲ့သို့သော အဆင့်များမှတစ်ဆင့် vitro တွင် ပုံတူကူးထားသည်။မိဘကြိုးမျှင်ပုံစံ DNA ၏သမီးကြိုးမျှင် DNA ၏လုပ်ငန်းစဉ်။

စံ PCR လုပ်ငန်းစဉ်ကို အဆင့်သုံးဆင့် ခွဲထားသည်။

1.Denaturation- DNA နှစ်ဆကို ခွဲထုတ်ရန် မြင့်မားသော အပူချိန်ကို အသုံးပြုပါ။DNA နှစ်လွှာကြားရှိ ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးသည် မြင့်မားသောအပူချိန် (93-98 ℃) တွင် ကျိုးသွားပါသည်။

2.Annealing- ကြိုးနှစ်ထပ် DNA ကို ပိုင်းခြားပြီးနောက်၊ primer သည် single-stranded DNA နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်စေရန် အပူချိန်ကို လျှော့ချပါ။

3. တိုးချဲ့မှု- အပူချိန် ကျဆင်းသွားသောအခါတွင် ချည်နှောင်ထားသော primers များမှ DNA ကြိုးများတစ်လျှောက် DNA polymerase သည် ဖြည့်စွက်စာများကို စတင်ပေါင်းစပ်သည်။တိုးချဲ့မှုကို ပြီးမြောက်သောအခါ၊ လည်ပတ်မှုတစ်ခုပြီးမြောက်ပြီး DNA အပိုင်းအစများ၏ အရေအတွက်သည် နှစ်ဆတိုးလာသည်။

ဤအဆင့်သုံးဆင့်ကို 25-35 ကြိမ်အပြန်အလှန်လုပ်ခြင်းဖြင့် DNA အပိုင်းအစများ၏အရေအတွက်သည် အဆတိုးလာမည်ဖြစ်သည်။

PCR ၏ ဉာဏ်ရည်ထက်မြက်မှုသည် မတူညီသော ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇများအတွက် ကွဲပြားသော primer များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ထားနိုင်သောကြောင့် ပစ်မှတ် gene အပိုင်းအစများကို အချိန်တိုအတွင်း ချဲ့ထွင်နိုင်မည်ဖြစ်သည်။

ယခုအချိန်အထိ PCR ကို သာမန် PCR၊ fluorescent quantitative PCR နှင့် digital PCR ဟူ၍ အမျိုးအစားသုံးမျိုး ခွဲခြားနိုင်သည်။

သာမန် PCR ၏ ပထမမျိုးဆက်

ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇကို ချဲ့ထွင်ရန် သာမန် PCR ချဲ့ထွင်သည့်ကိရိယာကို အသုံးပြုပါ၊ ထို့နောက် ထုတ်ကုန်ကိုသိရှိရန် agarose gel electrophoresis ကိုအသုံးပြု၍ အရည်အသွေးပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှသာ လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။

ပထမမျိုးဆက် PCR ၏အဓိကအားနည်းချက်များ

1. သီးခြားမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်ခြင်းနှင့် မှားယွင်းသော အပြုသဘောဆောင်သော ရလဒ်များကို အသုံးချပါ။

2. ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုသည် အချိန်ကြာမြင့်ပြီး လုပ်ဆောင်ချက်သည် ခက်ခဲသည်။

3. အရည်အချင်းစစ် စမ်းသပ်မှုသာ ပြုလုပ်နိုင်သည်။

ဒုတိယမျိုးဆက် Real-Time PCR

qPCR ဟုလည်းသိကြသော Real-Time PCR သည် တုံ့ပြန်မှုစနစ်၏တိုးတက်မှုကိုညွှန်ပြနိုင်သော fluorescent probes များကိုအသုံးပြုကာ၊ fluorescent signals များစုပုံခြင်းမှတစ်ဆင့် ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်များစုပုံလာခြင်းကို စောင့်ကြည့်စစ်ဆေးကာ ရလဒ်များကို fluorescence မျဉ်းကွေးဖြင့်အကဲဖြတ်သည်။၎င်းကို Cq တန်ဖိုးနှင့် စံမျဉ်းကွေးများ၏ အကူအညီဖြင့် တိုင်းတာနိုင်သည်။

qPCR နည်းပညာကို အလုံပိတ်စနစ်တွင် လုပ်ဆောင်သောကြောင့်၊ ညစ်ညမ်းမှုဖြစ်နိုင်ခြေကို လျော့ကျသွားကာ quantitative detection အတွက် fluorescence signal ကို စောင့်ကြည့်နိုင်သောကြောင့် ၎င်းသည် လက်တွေ့အလေ့အကျင့်တွင် အသုံးအများဆုံးဖြစ်ပြီး PCR တွင် လွှမ်းမိုးထားသောနည်းပညာဖြစ်လာသည်။

အချိန်နှင့်တပြေးညီ fluorescent quantitative PCR တွင်အသုံးပြုသည့် fluorescent အရာများကို- TaqMan fluorescent probe၊ molecular beacons နှင့် fluorescent dye ဟူ၍ခွဲခြားနိုင်သည်။

1) TaqMan ချောင်းထောက်လှမ်းမှု-

PCR ချဲ့ထွင်မှုအတွင်း၊ primer တစ်စုံကို ထည့်စဉ်တွင် သီးခြား fluorescent probe တစ်ခုကို ပေါင်းထည့်သည်။စူးစမ်းလေ့လာမှုသည် oligonucleotide ဖြစ်ပြီး၊ နှစ်ဖက်စလုံးသည် သတင်းထောက်ချောင်းအုပ်စုနှင့် quencher fluorescent အုပ်စုဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသည်။

စုံစမ်းစစ်ဆေးရေးအဖွဲ့သည် နဂိုအတိုင်းရှိနေသောအခါ သတင်းထောက်အဖွဲ့မှ ထုတ်လွှတ်သော ချောင်းအချက်ပြမှုကို quenching group မှ စုပ်ယူပါသည်။PCR ချဲ့ထွင်စဉ်တွင်၊ Taq အင်ဇိုင်း၏ 5′-3′ exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်သည် ပရိုတင်းကို ပြိုကွဲစေပြီး သတင်းထောက်အား ချောင်းများအုပ်စုနှင့် quencher ဖြစ်လာစေကာ fluorescent အုပ်စုကို ခွဲခြားထားသောကြောင့် fluorescence စောင့်ကြည့်ရေးစနစ်သည် fluorescence အချက်ပြမှုကို လက်ခံရရှိစေရန်၊ ဆိုလိုသည်မှာ DNA fluorescent strand ကို ချဲ့ထွင်လိုက်တိုင်း၊ a ၏ အချက်ပြမှုသည် fluorescent ဖြစ်သည်၊ PCR ထုတ်ကုန်ဖွဲ့စည်းခြင်းနှင့် လုံးဝထပ်တူပြုပါသည်။

2) SYBR ချောင်းဆိုးဆေး

PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် SYBR ချောင်းဆိုးဆေး၏ ပိုလျှံမှုကို ထည့်သွင်းထားသည်။SYBR ချောင်းဆိုးဆေးသည် DNA နှစ်ထပ်ကြိုးတွင် အတိအကျ မထည့်သွင်းပြီးနောက်၊ ၎င်းသည် ချောင်းအချက်ပြလှိုင်းကို ထုတ်လွှတ်သည်။ကွင်းဆက်တွင်မပါဝင်သည့် SYBR ဆိုးဆေးမော်လီကျူးသည် မည်သည့် fluorescent signal ကိုမျှ ထုတ်လွှတ်မည်မဟုတ်ပါ၊ ထို့ကြောင့် fluorescent signal ကိုသေချာစေခြင်းဖြင့် PCR ထုတ်ကုန်များ တိုးလာခြင်းသည် PCR ထုတ်ကုန်များ တိုးလာခြင်းနှင့် လုံးဝထပ်တူကျပါသည်။SYBR သည် ကြိုးနှစ်ထပ် DNA နှင့်သာ ချိတ်ဆက်ထားသောကြောင့် PCR တုံ့ပြန်မှုသည် တိကျမှုရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးကို အသုံးပြုနိုင်သည်။

3) မော်လီကျူး မီးရှူးတန်ဆောင်

၎င်းသည် ပင်မကွင်းစဥ်နှစ်ထပ်တံဆိပ်ပါသော oligonucleotide ပလေယာတစ်ခုဖြစ်ပြီး 5 နှင့် 3 စွန်းတွင် အစွပ် 8 ခုခန့်ရှိသော ဆံပင်ညှပ်ဖွဲ့စည်းပုံဖြစ်သည်။အစွန်းနှစ်ဖက်ရှိ နျူကလိစ်အက်ဆစ်အစီအစဥ်များကို ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်ထားသောကြောင့် ချောင်းအုပ်စုနှင့် ငြိမ်းသတ်အုပ်စုကို တင်းကျပ်စေပါသည်။ပိတ်ပါ၊ ချောင်းဆိုးထွက်မည်မဟုတ်ပါ။

PCR ထုတ်ကုန်ကို ထုတ်လုပ်ပြီးနောက်၊ ဖြာထွက်သည့် လုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ မော်လီကျူးမီးရှူးတန်ဆောင်၏ အလယ်အပိုင်းကို တိကျသော DNA အစီအစဉ်တစ်ခုဖြင့် တွဲစပ်ထားပြီး ချောင်း၏ဗီဇသည် အလင်းဖြာထွက်စေရန် quencher gene မှ ခွဲထုတ်ထားသည်။

ဒုတိယမျိုးဆက် PCR ၏အဓိကအားနည်းချက်များ

အာရုံခံနိုင်စွမ်း အားနည်းနေသေးပြီး ကော်ပီနည်းနမူနာများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုမှာ မမှန်ကန်ပါ။

နောက်ခံတန်ဖိုး၏ သြဇာလွှမ်းမိုးမှု ရှိပြီး ရလဒ်သည် အနှောင့်အယှက်ဖြစ်နိုင်ချေရှိသည်။

တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် PCR inhibitors များရှိနေသောအခါ၊ ထောက်လှမ်းမှုရလဒ်များသည် အနှောင့်အယှက်ဖြစ်နိုင်ချေရှိသည်။

တတိယမျိုးဆက် ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR

ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR (DigitalPCR၊ dPCR၊ Dig-PCR) သည် အဆုံးမှတ်ထောက်လှမ်းခြင်းမှတစ်ဆင့် ပစ်မှတ်အစီအစဥ်၏ မိတ္တူနံပါတ်ကို တွက်ချက်ပြီး အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုများနှင့် စံမျဉ်းကွေးများကို အသုံးမပြုဘဲ တိကျသော ပမာဏရှာဖွေခြင်းကို လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။

ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR သည် အဆုံးမှတ်ထောက်လှမ်းမှုကို အသုံးပြုပြီး Ct တန်ဖိုး (စက်ဝန်းအဆင့်သတ်မှတ်မှု) ပေါ်တွင်မူတည်ခြင်းမရှိသောကြောင့် ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR တုံ့ပြန်မှုသည် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကြောင့် ထိခိုက်မှုနည်းပြီး PCR တုံ့ပြန်မှုတားဆီးပိတ်ပင်ထားသောခံနိုင်ရည်ကို မြင့်မားသောတိကျမှုနှင့် မျိုးပွားနိုင်မှုတို့ဖြင့် မြှင့်တင်ထားသည်။

မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် တိကျမှုမြင့်မားသော ဝိသေသလက္ခဏာများကြောင့်၊ ၎င်းကို PCR တုံ့ပြန်မှု inhibitors များက အလွယ်တကူ ဝင်ရောက်စွက်ဖက်ခြင်းမပြုဘဲ၊ သုတေသနနှင့် အပလီကေးရှင်း ဟော့စပေါ့ဖြစ်လာသည့် စံထုတ်ကုန်များမပါဘဲ စစ်မှန်သော အကြွင်းမဲ့ပမာဏကို ရရှိနိုင်သည်။

တုံ့ပြန်မှုယူနစ်၏ မတူညီသောပုံစံများအရ ၎င်းကို microfluidic၊ chip နှင့် droplet systems ဟူ၍ သုံးမျိုးခွဲခြားနိုင်သည်။

1) Microfluidic ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR၊ mdPCR

microfluidic နည်းပညာကို အခြေခံ၍ DNA ပုံစံကို ခွဲခြားထားသည်။မိုက်ခရိုဖလူးဒစ်နည်းပညာသည် နမူနာ နာနိုအဆင့်မြှင့်တင်ခြင်း သို့မဟုတ် သေးငယ်သောအမှုန်အမွှားများ၏ မျိုးဆက်ကို သိရှိနိုင်သော်လည်း အမှုန်အမွှားများသည် အထူးစုပ်ယူမှုနည်းလမ်းတစ်ခု လိုအပ်ပြီး PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။mdPCR ကို အခြားနည်းလမ်းများဖြင့် အစားထိုးလက်ခံကျင့်သုံးခဲ့သည်။

2) Droplet-based ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR၊ ddPCR-

နမူနာကို အမှုန်အမွှားများအဖြစ် စီမံဆောင်ရွက်ရန် ရေတွင်ရှိသော ရေစက်များထုတ်လုပ်သည့်နည်းပညာကို အသုံးပြုကာ နျူကလိစ်အက်ဆစ်မော်လီကျူးများပါရှိသော တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကို ထောင်ပေါင်းများစွာသော နာနိုစကေးအမှုန်အမွှားများအဖြစ် ပိုင်းခြားရန်၊ တစ်ခုစီတွင် တွေ့ရှိရမည့် နျူကလိစ်အက်ဆစ်ပစ်မှတ်မော်လီကျူးမပါဝင်ပါ၊ သို့မဟုတ် စမ်းသပ်ရမည့် နျူကလိစ်အက်ဆစ်ပစ်မှတ်မော်လီကျူးတစ်ခုမှ တစ်ခုအထိ အများအပြားပါရှိသည်။

3) Chip-based ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR၊ cdPCR-

ပေါင်းစပ်အရည်လမ်းကြောင်းနည်းပညာကို ဆီလီကွန် wafers သို့မဟုတ် quartz glass တွင် ရေးထွင်းရန်၊ ကွဲပြားခြားနားသော ထိန်းချုပ်မှုအဆို့ရှင်များမှတစ်ဆင့် ဖြေရှင်းချက်စီးဆင်းမှုကို ထိန်းချုပ်ကာ နမူနာအရည်ကို အရွယ်အစားတူ အရွယ်အစားတူ နံနိုမီတာများအဖြစ် ဒစ်ဂျစ်တယ် PCR Reaction အတွက် တုံ့ပြန်မှုရေတွင်းများထဲသို့ ပိုင်းခြားပါ။

တတိယမျိုးဆက် PCR ၏အဓိကအားနည်းချက်များ

စက်ပစ္စည်းနှင့် ဓာတ်ပစ္စည်းများသည် ဈေးကြီးသည်။

နမူနာပုံစံ အရည်အသွေး လိုအပ်ချက်များသည် မြင့်မားသည်။နမူနာပုံစံ ပမာဏသည် မိုက်ခရိုစနစ် ပမာဏထက် ကျော်လွန်ပါက၊ ၎င်းကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် မဖြစ်နိုင်ကြောင်း၊ ၎င်းသည် အလွန်သေးငယ်ပါက၊ အရေအတွက် တိကျမှုကို လျှော့ချမည်ဖြစ်သည်။

အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုရှိပါက မှားယွင်းသော အပြုသဘောများကိုလည်း ထုတ်ပေးနိုင်သည်။