COVID-19 သည် Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2 ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ကူးစက်ရောဂါတစ်ခုဖြစ်သည်။ လူတစ်ဦး ကူးစက်ခံရသောအခါတွင် အဖြစ်များဆုံး ရောဂါလက္ခဏာများမှာ ဖျားခြင်း၊ ချောင်းဆိုးခြင်းနှင့် အသက်ရှူမဝခြင်းတို့ဖြစ်သည်။

စမ်းသပ်ရန်အတွက်အသုံးပြုသောနမူနာများကို nasopharyngeal swabs သို့မဟုတ် oropharyngeal swabs ဖြင့်စုဆောင်းနိုင်ပါသည်။

PCR ဆိုတာဘာလဲ။

ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ရှာဖွေခြင်း၏စံနည်းလမ်းမှာ polymerase ကွင်းဆက်တုံ့ပြန်မှု၊ PCR ဖြစ်သည်။၎င်းသည် မော်လီကျူး ဇီဝဗေဒတွင် တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုသည့် နည်းလမ်းဖြစ်သည်။၎င်းသည် သတ်မှတ်ထားသော DNA အပိုင်းအစ သန်းပေါင်းများစွာမှ သန်းပေါင်းများစွာသို့ လျင်မြန်စွာ ကူးယူနိုင်သည်။

ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အသစ်တွင် အလွန်ရှည်လျားသော သောင်တင်ထားသော RNA ဂျီနိုမ်တစ်ခုပါရှိသည်။PCR မှ ဤဗိုင်းရပ်စ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်ရန်၊ RNA မော်လီကျူးများကို ပြောင်းပြန် transcriptase ဖြင့် ၎င်းတို့၏ ဖြည့်စွက် DNA အတွဲများအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲရမည်ဖြစ်ပြီး၊ ထို့နောက် အသစ်ပေါင်းစပ်ထားသော DNA ကို RT-PCR ဟု အများအားဖြင့် သိကြသည့် စံ PCR လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများဖြင့် ချဲ့နိုင်သည်။

RT-PCR လုပ်ငန်းစဉ်

RNA ထုတ်ယူခြင်း။

ဤနည်းလမ်းကိုလုပ်ဆောင်ရန်၊ ဗိုင်းရပ်စ် RNA ကိုအခြေခံအားဖြင့်ထုတ်ယူသင့်သည်။အဆင်ပြေ၊ မြန်ဆန်ပြီး ထိရောက်စွာ ခွဲထုတ်ရန်အတွက် RNA သန့်စင်ရေးကိရိယာအစုံအလင်ကို အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။

ဗိုင်းရပ်စ် RNA ကို စီးပွားဖြစ်သုံးကိရိယာအစုံဖြင့် ထုတ်ယူရန်အတွက် နမူနာကို မိုက်ခရိုဝေ့ဖ်ဂတ်ပြွန်ထဲသို့ ဦးစွာထည့်ကာ lysis ကြားခံနှင့် ရောမွှေပါ။ဤကြားခံသည် အလွန်ပြင်းထန်ပြီး အများအားဖြင့် phenol နှင့် guanidine isothiocyanate ပါဝင်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ RNase inhibitors များသည် နဂိုဗိုင်းရပ် RNA ကို သီးခြားခွဲထုတ်ကြောင်း သေချာစေရန်အတွက် lysis ကြားခံများတွင် ရှိနေပါသည်။

lysis ကြားခံကို ပေါင်းထည့်ပြီးနောက်၊ ရောစပ်ပြွန်ကို သွေးခုန်နှုန်းဖြင့် သွေးလှည့်ပတ်ကာ အခန်းအပူချိန်တွင် သားဖောက်ပါ။ထို့နောက် lysis buffer မှပေးသော လွန်စွာ denaturing အခြေအနေများအောက်တွင် ဗိုင်းရပ်စ်ကို lyse လုပ်သည်။

နမူနာကို lysed ပြီးနောက်၊ သန့်စင်မှုလုပ်ငန်းစဉ်အတွက် centrifuge tube ကိုအသုံးပြုသည်။နမူနာကို စင်ထရစ်ဖန်ပြွန်ထဲသို့ ထည့်ပြီး အာရုံစူးစိုက်မှု ပြုလုပ်ပါ။

ဤလုပ်ထုံးလုပ်နည်းသည် စိမ်ခံအဆင့်ကို ထုတ်ယူသည့်နည်းလမ်းဖြစ်ပြီး တာယာအဆင့်တွင် ဆီလီကာဂျယ်မက်ထရစ်ပါ၀င်သည်။

အကောင်းဆုံးဆားနှင့် pH အခြေအနေများအောက်တွင်၊ RNA မော်လီကျူးများသည် ဆီလီကာအမြှေးပါးနှင့် ချိတ်ဆက်သည်။

တစ်ချိန်တည်းမှာပင် ပရိုတင်းနှင့် အခြားညစ်ညမ်းမှုများကို ဖယ်ရှားသည်။

Centrifugation ပြီးနောက်၊ စင်ထရီဖန်ပြွန်ကို သန့်ရှင်းသောစုဆောင်းမှုပြွန်ထဲသို့ထည့်ကာ filtrate ကိုစွန့်ပစ်ပြီးနောက် အဝတ်လျှော်ကြားခံထည့်ပါ။

အမြှေးပါးကိုဖြတ်၍ ဆေးကြားခံအား တွန်းထုတ်ရန် စင်ထရီဖန်းတွင် ပြွန်ကို ထပ်မံထည့်ပါ။၎င်းသည် အမြှေးပါးမှ ကျန်ရှိသော အညစ်အကြေးအားလုံးကို ဖယ်ရှားပေးမည်ဖြစ်ပြီး RNA သည် ဆီလီကာဂျယ်နှင့် ချည်နှောင်ထားခြင်းဖြစ်သည်။

နမူနာကို ဆေးကြောပြီးပါက ပြွန်ကို သန့်ရှင်းသော microcentrifuge ပြွန်ထဲသို့ ထည့်ကာ elution ကြားခံကို ထည့်ပါ။

ထို့နောက် အမြှေးပါးမှတဆင့် elution ကြားခံကို အတင်းတွန်းပို့ရန် ၎င်းကို ဗဟိုပြုသည်။elution ကြားခံသည် လှည့်ပတ်ကော်လံမှ ဗိုင်းရပ်စ် RNA ကို ဖယ်ရှားပြီး ပရိုတင်းများ၊ တားဆေးများနှင့် အခြားသော ညစ်ညမ်းမှုများ ကင်းစင်သော RNA ကို ရရှိသည်။

အဆင့် ၂

ရောနှောအာရုံစူးစိုက်မှု

ဗိုင်းရပ်စ် RNA ကိုထုတ်ယူပြီးနောက်၊ နောက်တစ်ဆင့်မှာ PCR ချဲ့ထွင်မှုအတွက် တုံ့ပြန်မှုအရောအနှောကို ပြင်ဆင်ရန်ဖြစ်သည်။ဤအဆင့်တွင် အာရုံစူးစိုက်မှုကို အသုံးပြုသည်။ဤစုစည်းထားသောဖြေရှင်းချက်သည် ပရီမီx၊ ပြောင်းပြန် transcriptase၊ nucleotides၊ ရှေ့သို့ primer၊ ပြောင်းပြန် primer၊ TaqMan probe နှင့် DNA polymerase တို့ပါ၀င်သော ပရီမီယံပေါင်းစပ်ထားသော စုစည်းဖြေရှင်းချက်ဖြစ်သည်။

နောက်ဆုံးတွင်၊ ဤတုံ့ပြန်မှုအရောအနှောကို အပြီးသတ်ရန်၊ RNA ပုံစံကို ထည့်သွင်းထားသည်။ပြွန်များကို pulse vortexing ဖြင့် ရောနှောပြီး တုံ့ပြန်မှုအရောအနှောကို PCR ပန်းကန်ထဲသို့ ထည့်ပေးသည်။PCR ပန်းကန်တွင် များသောအားဖြင့် ရေတွင်း ၉၆ တွင်းပါရှိပြီး နမူနာများစွာကို တစ်ချိန်တည်းတွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်သည်။

အဆင့် ၃

PCR ချဲ့ထွင်ခြင်း။

ထို့နောက်၊ အခြေခံအားဖြင့် အပူစက်ဘီးစီးသည့် PCR စက်တွင် ပန်းကန်ပြားကို ထည့်ပါ။

အချိန်နှင့်တပြေးညီ RT-PCR ကို RdrRP gene၊ E gene နှင့် N gene ရှိ ပစ်မှတ်အစီအစဥ်ကို ချဲ့ထွင်ခြင်းဖြင့် 2019 ဝတ္ထုကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန် အသုံးပြုပါသည်။ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇရွေးချယ်မှုသည် primer နှင့် probe sequence ပေါ်တွင်မူတည်သည်။

RT-PCR ၏ပထမအဆင့်သည် ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းဖြစ်သည်။ဖြည့်စွက် DNA ၏ ပထမကြိုးမျှင်ကို ဗိုင်းရပ်စ် RNA ဂျီနိုမ်၏ ဖြည့်စွက်အစိတ်အပိုင်းနှင့် ချိတ်ဆက်ပေးသော PCR ပြောင်းပြန် primer မှ အစပြုသော ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်ထားပါသည်။ထို့နောက် reverse transcriptase သည် ဗိုင်းရပ်စ် RNA နှင့် ပေါင်းစပ် DNA ကို ပေါင်းစပ်ရန်အတွက် primer ၏ 3′ အဆုံးတွင် DNA nucleotides ကို ပေါင်းထည့်သည်။ဤအဆင့်၏ အပူချိန်နှင့် ကြာချိန်သည် အသုံးပြုထားသော primers၊ ပစ်မှတ် RNA နှင့် reverse transcriptase တို့အပေါ် မူတည်ပါသည်။

ထို့နောက်၊ RNA-DNA hybrid ၏ denaturation ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် ကနဦး denaturation အဆင့်ကို အသုံးပြုသည်။DNA polymerase ကို အသက်သွင်းရန် ဤအဆင့်သည် လိုအပ်ပါသည်။တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ reverse transcriptase ကို အသက်မဝင်ပါ။

PCR တွင် အပူစက်ဝန်း စီးရီးများ ပါဝင်သည်။စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် denaturation၊ annealing နှင့် extension အဆင့်များပါရှိသည်။

denaturation အဆင့်တွင် တုံ့ပြန်မှုအခန်းကို 95 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်အထိ အပူပေးပြီး ကြိုးနှစ်ထပ် DNA ပုံစံပုံစံ၏ denaturation ပြုလုပ်ရန်အတွက် ၎င်းကို အသုံးပြုခြင်းတို့ ပါဝင်ပါသည်။

နောက်တစ်ဆင့်တွင်၊ တုံ့ပြန်မှုအပူချိန်ကို 58 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်သို့ လျှော့ချလိုက်ပြီး၊ ရှေ့သို့ primer သည် ၎င်း၏ single-stranded DNA နမူနာပုံစံ၏ ဖြည့်စွက်အစိတ်အပိုင်းသို့ ချိတ်ဆက်သွားနိုင်သည်။လိမ်းထားသောအပူချိန်သည် primer ၏အရှည်နှင့်ဖွဲ့စည်းမှုအပေါ်တိုက်ရိုက်မူတည်သည်။

တိုးချဲ့မှုအဆင့်တွင်၊ DNA polymerase သည် DNA နမူနာကြိုးမျှင်နှင့် လိုက်ဖက်သော DNA ကြိုးအသစ်ကို ပေါင်းစပ်သည်။တုံ့ပြန်မှုအရောအနှောမှ 5′မှ 3′ လမ်းညွှန်ချက်ရှိ နမူနာပုံစံသို့ အခမဲ့နျူကလီးယမ်ကို ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့်။ဤအဆင့်၏ အပူချိန်သည် အသုံးပြုထားသော DNA polymerase ပေါ်တွင် မူတည်သည်။

ပထမပတ်ပြီးနောက်၊ နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA ပစ်မှတ်ကို ရရှိသည်။

ထို့နောက် ဒုတိယစက်ဝန်းသို့ ဝင်ရောက်ပါ။ကြိုးနှစ်ထပ် DNA သည် single-stranded DNA မော်လီကျူးနှစ်ခုကို ထုတ်လုပ်ရန် denatured ဖြစ်သည်။

နောက်တစ်ဆင့်တွင်၊ တုံ့ပြန်မှုအပူချိန်ကို လျှော့ချလိုက်ပြီး၊ primers များကို single-stranded DNA template တစ်ခုစီတွင် စုပ်ယူထားပြီး Taq-man probe ကို ပစ်မှတ် DNA ၏ ဖြည့်စွက်အစိတ်အပိုင်းသို့ စုပ်ယူထားသည်။

TaqMan probe တွင် oligonucleotide probe ၏ 5′အစွန်းနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော fluorophore ပါဝင်သည်။စက်ဘီးစီးသူ၏ အလင်းရင်းမြစ်ကြောင့် စိတ်လှုပ်ရှားသောအခါ ဖလိုရိုဖလိုဖလိုဖလိုဖလိုဖရိုဖရီစဖန့်ကို ထုတ်လွှတ်သည်။ထို့အပြင်၊ probe သည် 3′အဆုံးတွင် quencher တစ်ခုဖြင့်ဖွဲ့စည်းထားသည်။quencher နှင့် သတင်းထောက် gene ၏ နီးစပ်မှု သည် fluorescence ၏ ထောက်လှမ်းမှုကို တားဆီးသည်။

တိုးချဲ့မှုအဆင့်တွင်၊ DNA polymerase သည် ကြိုးအသစ်တစ်ခုကို ပေါင်းစပ်သည်။Polymerase သည် TaqMan probe သို့ရောက်ရှိသောအခါ၊ ၎င်း၏ endogenous 5′ nuclease လုပ်ဆောင်ချက်သည် ဆီးခုံကို ခွာစေပြီး ဆိုးဆေးကို မီးသတ်စက်မှ ခွဲထုတ်သည်။

PCR ၏စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင်၊ ဆိုးဆေးမော်လီကျူးများ ပိုမိုထွက်ရှိလာပြီး ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ထားသော amplicons အရေအတွက်နှင့် အချိုးကျသော fluorescence ပြင်းအား တိုးလာစေသည်။

ဤနည်းလမ်းသည် နမူနာတွင်ပါရှိသော ပေးထားသော အစီအစဥ်အရေအတွက်ကို ခန့်မှန်းနိုင်စေပါသည်။နှစ်ထပ်သော DNA အပိုင်းအစများ၏ အရေအတွက်သည် စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် နှစ်ဆတိုးလာသည်။ထို့ကြောင့် PCR ကို အလွန်သေးငယ်သော နမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် အသုံးပြုနိုင်သည်။

မီးချောင်းအချက်ပြမှုကို တိုင်းတာရန်အတွက်၊ တန်စတင်ဟလိုဂျင်မီးအိမ်၊ စိတ်လှုပ်ရှားမှုစစ်ထုတ်စက်၊ ရောင်ပြန်ဟပ်မှု၊ မှန်ဘီလူး၊ ဓာတ်ငွေ့ထုတ်လွှတ်မှု စစ်ထုတ်မှုနှင့် အားသွင်းကိရိယာတွဲဖက်ထားသော- CCD ကင်မရာကို အသုံးပြုပါ။

အဆင့် 4 ကိုရှာဖွေပါ။

မီးချောင်းအချက်ပြမှုကို တိုင်းတာရန်အတွက်၊ တန်စတင်ဟလိုဂျင်မီးအိမ်၊ စိတ်လှုပ်ရှားမှုစစ်ထုတ်စက်၊ ရောင်ပြန်ဟပ်မှု၊ မှန်ဘီလူး၊ ဓာတ်ငွေ့ထုတ်လွှတ်မှု စစ်ထုတ်မှုနှင့် အားသွင်းကိရိယာတွဲဖက်ထားသော- CCD ကင်မရာကို အသုံးပြုပါ။

မီးအိမ်မှ စစ်ထုတ်ထားသော အလင်းရောင်ကို ရောင်ပြန်ဖြင့် ရောင်ပြန်ဟပ်ကာ ကွန်ဒင်ဆာမှန်ဘီလူးမှတဆင့် ဖြတ်သန်းကာ အပေါက်တစ်ခုစီ၏ အလယ်ဗဟိုသို့ အာရုံစူးစိုက်ထားသည်။ထို့နောက် အပေါက်မှ ထုတ်လွှတ်သော fluorescence သည် မှန်မှထင်ဟပ်ကာ emission filter မှတဆင့်ဖြတ်သန်းပြီး CCD ကင်မရာမှ ရှာဖွေတွေ့ရှိပါသည်။PCR လည်ပတ်မှုတစ်ခုစီတွင်၊ မိမိကိုယ်မိမိ စိတ်လှုပ်ရှားနေသော ဖလိုရိုဖလိုအလင်းကို CCD မှ သိရှိနိုင်သည်။

၎င်းသည် ဖမ်းယူထားသောအလင်းကို ဒစ်ဂျစ်တယ်ဒေတာအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲပေးသည်။ဤနည်းလမ်းကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR ဟုခေါ်ပြီး ၎င်းသည် PCR တုံ့ပြန်မှု၏တိုးတက်မှုကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ စောင့်ကြည့်နိုင်စေသည်။