လူတိုင်းသည် qRT-PCR စမ်းသပ်မှု၏နိယာမ၊ primer ဒီဇိုင်း၊ ရလဒ်အဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုချက်စသည်ဖြင့်ပြောနေကြသည်၊ သို့သော် qRT-PCR ၏စမ်းသပ်လုပ်ဆောင်မှုကိုသင့်အားမျှဝေသင့်သည်ဟုကျွန်ုပ်ထင်ပါတယ်။သေးငယ်ပေမယ့် ရလဒ်တွေအကြောင်းပါ။

qRT-PCR မလုပ်ဆောင်မီ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏ကိုယ်ပိုင် RNA နှင့် လည်ပတ်မှုနည်းလမ်းများကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း နားလည်ထားရန် လိုအပ်ပါသည်။အမှန်တော့၊ ရိုးရှင်းစွာ လေ့ကျင့်ခြင်းထက် ကျွန်ုပ်တို့၏ ကြိုးစားအားထုတ်မှုများသည် ရလဒ်များရရှိရန် ရည်ရွယ်ပါသည်။ထို့ကြောင့် qRT-PCR မလုပ်ဆောင်မီ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အောက်ပါပြဿနာများ (အချို့ကို SYBR နှင့်သာ သက်ဆိုင်သည်) ဆုံးဖြတ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။

1 သင့် RNA သည် ပျက်ယွင်းနေသည်မှာ သေချာပါသလား။

NanoDrop 2000 သည် RNA ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် သန့်စင်မှုကိုသာ ထောက်လှမ်းနိုင်သော်လည်း RNA ၏ သမာဓိကို မတွေ့နိုင်ပါ။

RNA (RNA Intesity Number) တန်ဖိုးသည် Agilent 2100 Bioanalyzer စနစ်မှ ရှာဖွေတွေ့ရှိသည့် RNA ၏ ခိုင်မာမှုကို ရောင်ပြန်ဟပ်နိုင်သည်။

ပုံ။ မတူညီသော RNA နမူနာများ (eukaryotes) အတွက် RIN တန်ဖိုးများ ဇယားကွက်

သို့သော်၊ ယေဘုယျအားဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းများတွင် Agilent 2100 Bioanalyzer မရှိပါ။ဤကိစ္စတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် formaldehyde gel မှတဆင့်သိရှိနိုင်သော်လည်း RNA ၏စုစုပေါင်းပမာဏအတွက်လိုအပ်ချက်သည်မြင့်မားသည်၊ ထို့ကြောင့်အမြန်ဆုံးနည်းလမ်းမှာသာမန်ဂျယ် electrophoresis ကိုအသုံးပြုရန်ဖြစ်သည်။၎င်းသည် နျူကလီးယားကင်းစင်သောပတ်ဝန်းကျင်တွင်ရှိနေရန် လိုအပ်သောကြောင့် electrophoresis tank၊ sol ပုလင်း၊ gel bracket နှင့် DEPC ရေဖြင့် ဆေးကြောရန် လိုအပ်ပါသည်။agarose သည် နူကလီးယားကင်းစင်သည် (၎င်းကို လတ်လတ်ဆတ်ဆတ်ဖွင့်ထားသရွေ့) နှင့် Loading Buffer ကို 1.2% gel ဖြင့် တတ်နိုင်သမျှ လတ်လတ်ဆတ်ဆတ်ဖွင့်သင့်သည်။

ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း နမူနာ 9 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း ဂျယ်လ်ကို လုံးဝပျော်စေရမည်၊ မဟုတ်ပါက ၎င်းသည် တစ်သားတည်းဖြစ်နေသောကြိုးများဖြစ်စေမည်ကို သတိပြုပါ။ဗို့အားမြင့်လွန်းပါက သို့မဟုတ် အကြာကြီးလည်ပတ်ပါက အပူကိုထုတ်ပေးပြီး RNA ပျက်ယွင်းစေသည်၊ ထို့ကြောင့် ဗို့အားနှင့်အချိန်ကို ကျိုးကြောင်းဆီလျော်စွာ ထိန်းချုပ်သင့်သည်။ထို့အပြင်၊ ဂျယ်ပြေးခြင်းသည် နမူနာတွင် DNA အကြွင်းအကျန်ရှိမရှိကို ထပ်မံဆုံးဖြတ်နိုင်ပြီး ဖြန့်ဝေပေးသည့်ရေတွင်းတွင် သိမ်းဆည်းထားသောကြိုးများ အများအပြားရှိမရှိကို စောင့်ကြည့်လေ့လာနိုင်ပါသည်။

ပုံ။RNA ၏ Gel electrophoresis ထောက်လှမ်းခြင်း။

2 သင့် cDNA ၏အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့်ပတ်သက်၍ သေချာပါသလား။

ဓာတ်ခွဲခန်းရှိ ညီအစ်ကိုကြီးများ၏ အတွေ့အကြုံမှာ ပြောင်းပြန်လှန်မှုတစ်ခုစီမှရရှိသော 20 ul စနစ်၏ cDNA ကို 20X တိုက်ရိုက် မှေးမှိန်စေပြီး ပါရဂူဘွဲ့လွန်ညီအစ်မများကို 10X မှေးမှိန်စေပါသည်။ကျွန်တော်ကတော့ အခြေအနေပေါ်မူတည်ပါတယ်။လူတစ်ဦးစီမှ ဖော်ပြထားသော RNA ၏ အရည်အသွေးသည် မတူညီသောကြောင့်၊ ပြောင်းပြန်လှန်ခြင်းအဆင့်မှာလည်း ကွဲပြားပြီး ပြောင်းပြန်လှန်သည့်နည်းပညာသည် မတည်ငြိမ်နိုင်ပါ။

ထို့ကြောင့် ပြောင်းပြန် cDNA ကိုရတိုင်း၊ ကျွန်ုပ်သည် ၎င်းကို ၃ ကြိမ်ခန့် ပထမဦးစွာ ရေဆေးပြီး RT-PCR ပြုလုပ်ရန် အိမ်တွင်းရေးဗီဇကို အသုံးပြုကာ၊ ယေဘုယျအားဖြင့် သံသရာအရေအတွက်သည် 25 cycles ဖြစ်ပြီး၊ တိကျသောအာရုံစူးစိုက်မှုကို ဖော်ထုတ်ရန်၊ ထို့နောက် နောက်ဆုံး dilution factor ကို ဆုံးဖြတ်ရန်ဖြစ်သည်။

3 သင်၏ primer သည် အသုံးပြုရလွယ်ကူကြောင်း သေချာပါသလား။

၎င်းသည် qRT-PCR ၏ အရည်ပျော်မျဉ်းကို ကျော်ဖြတ်နိုင်သော်လည်း ၎င်းသည် ငွေကြေးကုန်ကျဆဲဖြစ်သည်။ပိုက်ဆံအများကြီးမပါတဲ့ ဓာတ်ခွဲခန်းတွေအတွက်၊ primers တွေ အများကြီးရတဲ့အခါ၊ အဲဒါက single band တစ်ခုဟုတ်မဟုတ် သိဖို့နဲ့ primers တွေရဲ့ တိကျမှုကို ခွဲခြားသိရှိနိုင်ဖို့ သာမန် RT-PCR ကို သုံးနိုင်ပါတယ်။ဓာတ်ခွဲခန်းသည် ငွေမလုံလောက်ပါက၊ primer များအားလုံး၏ တိကျမှုကို အရည်ပျော်မျဉ်းကြောင်းမှ တစ်ကြိမ် ဖော်ထုတ်နိုင်သည်။

4 သင့်စမ်းသပ်မှုအခြေအနေများ သင့်လျော်ကြောင်း သေချာပါသလား။

SYBR သည် ပြင်းထန်သောအလင်းရောင်မှကာကွယ်ထားသင့်သည်၊ ထို့ကြောင့် SYBR ဓာတ်ပစ္စည်းများထည့်သောအခါတွင် အပေါ်မှမီးကိုပိတ်ရန်ကြိုးစားပြီး ပြီးမြောက်ရန် မီးမှိန်မှိန်ကိုသာအသုံးပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။

SYBR ကို 4°C တွင် သိမ်းဆည်းပါ။အသုံးပြုသည့်အခါတွင် အမြှုပ်ထွက်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် ကောင်းစွာရောနှောရန် အပေါ်နှင့်အောက်ကို ညင်သာစွာ ပြောင်းပြန်လှန်ကာ ရေဝဲခြင်းအား ပြင်းပြင်းထန်ထန် မလုပ်ပါနှင့်။

ညီအစ်မအချို့သည် မှားယွင်းသောနမူနာများကို ရောနှောမိမည်ကို စိုးရိမ်သောကြောင့် PCR ဘုတ်ပေါ်တွင် အမှတ်အသားဆွဲချင်ကြသည်။သင့်အမှတ်အသားများသည် မီးချောင်းများစုစည်းမှုအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိနိုင်သောကြောင့်၊ အောက်ဖော်ပြပါအတိုင်း မှတ်ဉာဏ်ကိုအထောက်အကူပြုရန် စမ်းသပ်မှတ်စုစာအုပ်များကို အသုံးပြုရန် ယေဘူယျအားဖြင့် ကျွန်ုပ်အကြံပြုပါသည်။

ပုံ။qRT-PCR နမူနာတင်ခြင်း diagram

5 မင်းလုပ်တာ မှန်နေတာ သေချာလား။

လက်အိတ်ဝတ်ပါ၊ လက်အိတ်ဝတ်ပါ၊ လက်အိတ်ဝတ်ပါ၊ အရေးကြီးသောအရာများကို သုံးကြိမ်ပြောပါ။

SYBR ၏အလင်းထိတွေ့မှုကို လျှော့ချရန်အတွက်၊ အောက်ဖော်ပြပါပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း ပထမဆုံး နမူနာပုံစံတစ်ခုကို ကျွန်ုပ်ကိုယ်တိုင်ထည့်သွင်းလိုပါသည်။အတွေ့အကြုံအရ၊ ပုံစံပလိတ်အနည်းငယ်ကို ထပ်ထည့်ခြင်းသည် နမူနာယူခြင်းဆိုင်ရာ အမှားအယွင်းများကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ထို့ကြောင့်၊ template အနည်းငယ်ကိုထည့်ခြင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော အမှားအယွင်းကို လျှော့ချရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်သည် ပုံမှန်အားဖြင့် နမူနာကို ထပ်မံ၍ နှစ်ဆပေးပြီး H2O2 ပမာဏကို လျှော့ချရန်အတွက် နမူနာကို ထပ်ထည့်သည့်အခါ ပမာဏ၏ နှစ်ဆဖြစ်သည်။

ပုံ။qRT-PCR တင်ခြင်း၏ ဇယားကွက်

ထို့နောက် qRT-PCR စနစ်အား အောက်ပါအတိုင်း configure လုပ်ပါ။

ပုံ။qRT-PCR စနစ်ပြင်ဆင်မှု ပုံကြမ်း

မှတ်ချက်- configuration လုပ်ငန်းစဉ်ကို ရေခဲပေါ်တွင် လုပ်ဆောင်ရန် လိုအပ်သည်။

နမူနာကို ပေါင်းထည့်ပြီးနောက် ဖောက်ထွင်းမြင်ရသော အလုံပိတ်ရုပ်ရှင်ကို ကူးထည့်ပါ။ဖောက်ထွင်းမြင်ရသော အလုံပိတ်ဖလင်၏ မျက်နှာပြင်ကို လက်ဖြင့် မထိမိစေရန် ကြိုးစားပါ၊ ဖလင်၏ နှစ်ဖက်စလုံးရှိ နေရာလွတ်မှ လည်ပတ်ပါ။လက်ဗွေရာများသည် ချောင်းအချက်ပြမှုများ စုစည်းမှုကိုလည်း ထိခိုက်စေနိုင်သောကြောင့် ဖြစ်သည်။ထို့နောက်နမူနာကို နံရံတွင်တွဲလောင်းကျခြင်းမှကာကွယ်ရန် အရှိန်နိမ့်သောအားဖြင့် 10 စက္ကန့်ကြာ centrifuge ကိုသုံးပါ။

ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-

ဆဲလ်တိုက်ရိုက် RT-qPCR အစုံ

RT Easy II