RT-qPCR သည် သာမန် PCR နည်းပညာမှ ဖန်တီးထားခြင်း ဖြစ်သည်။၎င်းသည် သမားရိုးကျ PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် ချောင်းဆိုးဆေးများ (ချောင်းဆိုးဆေး သို့မဟုတ် မီးချောင်းစုံစမ်းစစ်ဆေးခြင်း) ကို ပေါင်းထည့်ကာ ၎င်းတို့၏ မတူညီသော အလင်းရောင်ယန္တရားများအလိုက် PCR ဖြာထွက်ခြင်းနှင့် တိုးချဲ့ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ သိရှိနိုင်သည်။PCR ၏ စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် ထုတ်ကုန်ပြောင်းလဲမှုပမာဏကို တွက်ချက်ရန်အတွက် ကြားခံတွင် fluorescent အချက်ပြပြောင်းလဲမှုများကို အသုံးပြုပါသည်။လက်ရှိတွင် အသုံးအများဆုံးနည်းလမ်းများမှာ ချောင်းဆိုးဆေးနည်းလမ်းနှင့် စူးစမ်းလေ့လာသည့်နည်းလမ်းဖြစ်သည်။

မီးချောင်းဆိုးဆေးနည်းလမ်း
SYBR Green Ⅰ၊ PicoGreen၊ BEBO ကဲ့သို့သော ချောင်းဆိုးဆေးအချို့သည် ၎င်းတို့ကိုယ်တိုင် အလင်းရောင်မထုတ်လွှတ်ဘဲ dsDNA ၏သေးငယ်သောအပေါက်နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် အလင်းရောင်ထုတ်လွှတ်သည်။ထို့ကြောင့် PCR တုံ့ပြန်မှုအစတွင်၊ စက်သည် fluorescent အချက်ပြမှုကို မတွေ့ရှိနိုင်ပါ။တုံ့ပြန်မှုသည် annealing-extension (နှစ်ဆင့်နည်းလမ်း) သို့မဟုတ် တိုးချဲ့မှုအဆင့် (အဆင့်သုံးဆင့်နည်းလမ်း) သို့ ရောက်သွားသောအခါ၊ ကြိုးနှစ်ထပ်ကိုဖွင့်ပြီး DNA polymerase အသစ်ကို strand ပေါင်းစပ်စဉ်အတွင်း၊ fluorescent မော်လီကျူးများကို dsDNA အသေးစား groove တွင် ပေါင်းစပ်ပြီး fluorescence ထုတ်လွှတ်ပါသည်။PCR လည်ပတ်မှု အရေအတွက် တိုးလာသည်နှင့်အမျှ၊ ဆိုးဆေးများသည် dsDNA နှင့် ပေါင်းစပ်ကာ အလင်းတန်းအချက်ပြမှုကိုလည်း စဉ်ဆက်မပြတ် မြှင့်တင်ပေးပါသည်။ဥပမာအနေနဲ့ SYBR Green Ⅰ ကို ယူပါ။
စုံစမ်းစစ်ဆေးရေးနည်းလမ်း-
Taqman probe သည် အသုံးအများဆုံး hydrolysis probe ဖြစ်သည်။များသောအားဖြင့် FAM ၏ 5′ အဆုံးတွင် ချောင်းအုပ်စုတစ်ခုရှိသည်။စူးစမ်းလေ့လာမှုကိုယ်တိုင်က ပစ်မှတ် ဗီဇနှင့် လိုက်ဖက်သော စီးရီးတစ်ခုဖြစ်သည်။fluorophore ၏ 3′ ၏အဆုံးတွင် fluorescent quenching group ရှိသည်။fluorescence resonance စွမ်းအင်လွှဲပြောင်းခြင်းနိယာမအရ (Förster resonance energy transfer, FRET)၊ သတင်းထောက် fluorescent အုပ်စု (donor fluorescent molecule) နှင့် quenching fluorescent group (acceptor fluorescent molecule) သည် excitation spectrum overlaps and the distance is very close is when the fluorescence the molecule of the excitation of the excitation can or the excitation of the excitation of the molecule, the excitation of the excitation of 7-10nm). မော်လီကျူး၊ autofluorescence အားနည်းနေချိန်တွင်။ထို့ကြောင့်၊ PCR တုံ့ပြန်မှုအစတွင်၊ စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုစနစ်တွင် အခမဲ့ဖြစ်ပြီး နဂိုအတိုင်းရှိသည့်အခါ သတင်းထောက် fluorescent အုပ်စုသည် fluorescence ကို ထုတ်လွှတ်မည်မဟုတ်ပါ။လိမ်းသောအခါတွင် primer နှင့် probe ကို template နှင့် ချိတ်ပါ။တိုးချဲ့မှုအဆင့်တွင်၊ ပိုလီမာရတ်သည် ကွင်းဆက်အသစ်များကို စဉ်ဆက်မပြတ် ပေါင်းစပ်သည်။DNA polymerase တွင် 5′-3′ exonuclease လုပ်ဆောင်ချက် ပါရှိသည်။probe သို့ရောက်ရှိသောအခါ၊ DNA polymerase သည် template မှ probe ကို hydrolyze လုပ်မည်ဖြစ်ပြီး၊ reporter fluorescent group ကို quencher fluorescent group မှ ခွဲထုတ်ပြီး fluorescent signal ကို ထုတ်လွှတ်မည်ဖြစ်ပါသည်။probe နှင့် template အကြား တစ်ခုမှတစ်ခု ဆက်စပ်မှုရှိသောကြောင့်၊ probe method သည် စစ်ဆေးမှု၏ တိကျမှုနှင့် sensitivity အရ ဆိုးဆေးနည်းလမ်းထက် သာလွန်ပါသည်။

ပုံ 1 qRT-PCR ၏အခြေခံမူ

Primer ဒီဇိုင်း
အခြေခံမူများ-

primers များသည် nucleic acid series ၏ ထိန်းသိမ်းထားသော ဒေသတွင် ပုံစံထုတ်ထားပြီး တိကျမှုရှိသင့်သည်။

cDNA sequence ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်ပြီး mRNA sequence ကိုလည်း လက်ခံနိုင်သည်။မဟုတ်ပါက DNA sequence ၏ cds ဒေသဒီဇိုင်းကို ရှာဖွေပါ။
fluorescent quantitative ထုတ်ကုန်၏အရှည်မှာ 80-150bp၊ အရှည်ဆုံးမှာ 300bp၊ primer အရှည်သည် ယေဘုယျအားဖြင့် 17-25 bases ကြားဖြစ်ပြီး၊ အထက်ပိုင်းနှင့် downstream primers တို့၏ ကွာခြားချက်မှာ အလွန်မကြီးသင့်ပါ။

G+C ပါဝင်မှုသည် 40% နှင့် 60% ကြားဖြစ်ပြီး 45-55% သည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။
TM တန်ဖိုးသည် 58-62 ဒီဂရီကြားတွင်ရှိသည်။
primer dimers နှင့် self-dimers များကိုရှောင်ရှားရန်ကြိုးစားပါ၊ (ဆက်တိုက်အပါအ၀င်အစွပ် 4 အတွဲထက် ပိုမပေါ်ပါနှင့်) hairpin ဖွဲ့စည်းပုံကို ရှောင်လွှဲ၍မရပါက ΔG<4.5kJ/mol* ဖြစ်အောင် gDNA ကို reverse transcription Clean လုပ်နေစဉ်အတွင်း gDNA ကို ဖယ်ရှားလိုက်ကြောင်း သေချာမဆောင်ရွက်နိုင်ပါက၊ intron ၏ primers များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည် G ၏ အဆက်မပြတ် * 3′၊ AT/C ဖွဲ့စည်းပုံကို ရှောင်ရှားရန်၊ ကြွယ်ဝသော၊ AT/C တည်ဆောက်မှုကို ရှောင်ရှားရန်၊ 2-3) primers နှင့် non-
အတိအကျ ကွဲကွဲပြားပြား ချဲ့ထွင်ထားသော အစီအစဥ်၏ သံယောဇဉ်သည် ပိုကောင်းသည်မှာ 70% ထက်နည်းသော သို့မဟုတ် ဖြည့်စွက်အခြေခံအမျိုးအစား 8 ခုပါရှိသည်။
ဒေတာဘေ့စ်-
CottonFGD သော့ချက်စာလုံးများဖြင့် ရှာဖွေခြင်း။
Primer ဒီဇိုင်း
IDT-qPCR primer ဒီဇိုင်း

Fig2 IDT အွန်လိုင်း primer ဒီဇိုင်းတူးလ် စာမျက်နှာ

Fig3 ရလဒ်စာမျက်နှာပြသခြင်း။
lncRNA primers ဒီဇိုင်း
lncRNA-mRNA နှင့် တူညီသော အဆင့်များ။
miRNA-stem-loop method ၏နိယာမ- miRNA များအားလုံးသည် 23 nt ခန့်ရှိသော တိုတောင်းသော sequences ဖြစ်သောကြောင့်၊ တိုက်ရိုက် PCR detection မလုပ်နိုင်သောကြောင့် stem-loop sequence tool ကို အသုံးပြုပါသည်။ပင်မကွင်းဆက်သည် 50 nt ခန့်ရှိသော ကြိုးမျှင် DNA တစ်ခုဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် သူ့ဘာသာသူ ဆံပင်ညှပ်ဖွဲ့စည်းပုံကို ဖန်တီးနိုင်သည်။3 'အဆုံးအား miRNA တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအပိုင်းတစ်ပိုင်း၏ အဆက်အစပ်တစ်ခုအဖြစ် ဒီဇိုင်းရေးဆွဲနိုင်ပြီး၊ ထို့နောက်တွင် ပစ်မှတ် miRNA အား ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြစဉ်တွင် ပင်မကွင်းဆက်ကွင်းဆက်သို့ ချိတ်ဆက်နိုင်ပြီး စုစုပေါင်းအရှည်သည် qPCR မှသတ်မှတ်ထားသော ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်၏အရှည်နှင့်အညီ 70bp အထိရောက်ရှိနိုင်သည်။tailing miRNA primer ဒီဇိုင်း။
ချဲ့ထွင်မှု-တိကျသော ထောက်လှမ်းမှု-
အွန်လိုင်းပေါက်ကွဲမှုဒေတာဘေ့စ်- CottonFGD သည် အစီအစဥ်အလားတူအားဖြင့် ပေါက်ကွဲမှု
Local blast- Local blast ကိုပြုလုပ်ရန် Blast+ ကိုအသုံးပြုခြင်းကို ကိုးကားပါ၊ linux နှင့် macos တို့သည် local database တစ်ခုကို တိုက်ရိုက်တည်ဆောက်နိုင်သည်၊ win10 system သည် ubuntu bash ကိုထည့်သွင်းပြီးနောက်တွင်လည်း လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။Local blast database နှင့် local blast ကိုဖန်တီးပါ။win10 တွင် ubuntu bash ကိုဖွင့်ပါ။
သတိပြုရန်- တောင်ယာချည်နှင့် ပင်လယ်ကျွန်းချည်တို့သည် tetraploid သီးနှံများဖြစ်သည်၊ ထို့ကြောင့် ပေါက်ကွဲမှု၏ရလဒ်သည် မကြာခဏဆိုသလို နှစ်ခု သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပို၍ ကိုက်ညီနေလိမ့်မည်။ယခင်က၊ NAU cds များကို ပေါက်ကွဲမှုလုပ်ဆောင်ရန် ဒေတာဘေ့စ်အဖြစ်အသုံးပြုခြင်းသည် SNP ကွဲပြားမှုအနည်းငယ်သာရှိသော မျိုးရိုးဗီဇနှစ်မျိုးကို ရှာဖွေနိုင်ဖွယ်ရှိသည်။အများအားဖြင့်၊ မျိုးရိုးဗီဇနှစ်ခုကို primer ဒီဇိုင်းဖြင့် မခွဲခြားနိုင်ပါ၊ ထို့ကြောင့် ၎င်းတို့ကို တူညီသည်ဟု ခံယူထားသည်။သိသာထင်ရှားသော indel တစ်ခုရှိလျှင် primer ကို indel တွင်ပုံမှန်အားဖြင့်ဒီဇိုင်းထုတ်သည်၊ သို့သော်၎င်းသည် primer ၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံကိုဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ လွတ်လပ်သောစွမ်းအင်သည်ပိုမိုမြင့်မားလာပြီးချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကိုကျဆင်းစေသည်၊ သို့သော်၎င်းသည်ရှောင်လွှဲ၍မရပါ။

primer အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံကို ထောက်လှမ်းခြင်း-
အဆင့်များ-oligo 7 ကိုဖွင့်ပါ → ထည့်သွင်းမှုပုံစံ နမူနာအစီအစဉ် → ဝင်းဒိုးခွဲခွဲကို ပိတ်ပါ → သိမ်းဆည်းခြင်း → နမူနာပုံစံပေါ်ရှိ primer ကိုရှာပါ၊ primer အရှည်သတ်မှတ်ရန် ctrl+D ကိုနှိပ်ပါ → ကွဲပြားသောကိုယ်ထည်၊ heterodimer၊ hairpin၊ မကိုက်ညီမှုစသည်ဖြင့် အမျိုးမျိုးသောနောက်ထပ်ဖွဲ့စည်းပုံကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါ။ ပုံ 4 ရှိ နောက်ဆုံးပုံနှစ်ပုံသည် primer ၏စမ်းသပ်မှုရလဒ်များဖြစ်သည်။ရှေ့ primer ၏ရလဒ်သည်ကောင်းမွန်သည်၊ သိသာထင်ရှားသော dimer နှင့် hairpin ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံမရှိပါ၊ စဉ်ဆက်မပြတ်အပါအ ၀ င်အစွပ်များမရှိပါ၊ အခမဲ့စွမ်းအင်၏ပကတိတန်ဖိုးမှာ 4.5 ထက်နည်းသည်၊ နောက်ဘက် primer သည် အဆက်မပြတ်ပြသနေချိန်တွင် 6 bases သည်အဆက်ပြတ်နေပြီးအခမဲ့စွမ်းအင်မှာ 8.8;ထို့အပြင်၊ 3′ အဆုံးတွင် ပိုမိုလေးနက်သော dimer တစ်ခုပေါ်လာပြီး 4 ဆက်တိုက် bases ၏ dimer တစ်ခုပေါ်လာသည်။အခမဲ့စွမ်းအင်သည် မမြင့်မားသော်လည်း 3′ dimer Chl သည် ချဲ့ထွင်မှုဆိုင်ရာ တိကျမှုနှင့် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို ပြင်းထန်စွာ ထိခိုက်စေနိုင်သည်။ထို့အပြင်၊ ဆံညှပ်များ၊ heterodimers နှင့် မကိုက်ညီမှုများ ရှိမရှိ စစ်ဆေးရန် လိုအပ်ပါသည်။

Fig3 oligo7 ထောက်လှမ်းမှုရလဒ်များ
ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်ကို သိရှိခြင်း-
PCR တုံ့ပြန်မှု၏ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် PCR ရလဒ်များကို ပြင်းထန်စွာ သက်ရောက်မှုရှိသည်။qRT-PCR တွင်လည်း၊ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် အရေအတွက်ရလဒ်များအတွက် အထူးအရေးကြီးပါသည်။တုံ့ပြန်မှုကြားခံရှိ အခြားအရာများ၊ စက်များနှင့် ပရိုတိုကောများကို ဖယ်ရှားပါ။primers များ၏အရည်အသွေးသည် qRT-PCR ၏ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုအပေါ်လည်းလွှမ်းမိုးမှုရှိသည်။ရလဒ်များ၏တိကျမှုကိုသေချာစေရန်အတွက်၊ နှိုင်းရမီးချောင်း ပမာဏနှင့် အကြွင်းမဲ့ fluorescence quantification နှစ်ခုစလုံးသည် primers ၏ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုကို သိရှိရန် လိုအပ်ပါသည်။ထိရောက်သော qRT-PCR ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်သည် 85% နှင့် 115% ကြားရှိကြောင်း အသိအမှတ်ပြုပါသည်။နည်းလမ်းနှစ်ခုရှိသည်။
1. စံမျဉ်းကွေးနည်းလမ်း-
acDNA ကို ရောစပ်ပါ။
ခအရောင်ဖျော့ဖျော့
c.qPCR
ဃ။ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကိုတွက်ချက်ရန် linear regression equation
2. LinRegPCR
LinRegPCR သည် SYBR Green သို့မဟုတ် အလားတူ ဓာတုဗေဒကို အခြေခံ၍ ပမာဏ PCR (qPCR) ဒေတာဟုခေါ်သော အချိန်နှင့်တပြေးညီ RT-PCR ဒေတာကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် ပရိုဂရမ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ပရိုဂရမ်သည် အခြေခံမျဉ်းမဟုတ်သော ပြုပြင်ထားသောဒေတာကို အသုံးပြုကာ နမူနာတစ်ခုစီတွင် အခြေခံမျဉ်းပြင်ဆင်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်၊ သီးခြားစီ၊ ဝင်းဒိုး၏ linearity ကို ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက် PCR ဒေတာအတွဲမှတဆင့် မျဉ်းဖြောင့်တစ်ခုကို အံဝင်ခွင်ကျဖြစ်စေရန်အတွက် linear regression analysis ကိုအသုံးပြုသည်။ဤမျဉ်း၏စောင်းမှနမူနာတစ်ခုစီ၏ PCR ထိရောက်မှုကို တွက်ချက်သည်။amplicon တစ်ခုစီအတွက် ပျမ်းမျှ PCR ထိရောက်မှုနှင့် နမူနာတစ်ခုလျှင် Ct တန်ဖိုးကို မတရား fluorescence ယူနစ်များတွင် ဖော်ပြထားသော နမူနာတစ်ခုလျှင် စတင်သည့်အာရုံစူးစိုက်မှုကို တွက်ချက်ရန်အတွက် အသုံးပြုပါသည်။ဒေတာထည့်သွင်းခြင်းနှင့် အထွက်များသည် Excel စာရင်းဇယားတစ်ခုမှတစ်ဆင့် ဖြစ်သည်။နမူနာမျှသာ
ရောစပ်ရန် လိုအပ်သည်၊ gradient မရှိပါ။
အဆင့်များ လိုအပ်သည်-(ဥပမာတစ်ခုအနေနဲ့ Bole CFX96 ကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ABI ပါတဲ့ စက်မဟုတ်ပါ)
စမ်းသပ်ချက်-၎င်းသည် စံ qPCR စမ်းသပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။
qPCR ဒေတာအထွက်-LinRegPCR သည် အထွက်ဖိုင်ပုံစံနှစ်မျိုးကို မှတ်မိနိုင်သည်- RDML သို့မဟုတ် ပမာဏချဲ့ထွင်မှုရလဒ်။အမှန်မှာ၊ ၎င်းသည် စက်မှ စက်ဝန်းနံပါတ်နှင့် fluorescence အချက်ပြမှု၏ အချိန်နှင့်တပြေးညီ ထောက်လှမ်းမှုတန်ဖိုးဖြစ်ပြီး linear segment ထိရောက်မှု၏ fluorescence ပြောင်းလဲမှုတန်ဖိုးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ချဲ့ထွင်မှုကို ရရှိသည်။
ဒေတာရွေးချယ်မှု: သီအိုရီအရ၊ RDML တန်ဖိုးသည် အသုံးပြုနိုင်သည်။ကျွန်ုပ်၏ကွန်ပြူတာ၏ပြဿနာမှာ software သည် RDML ကို အသိအမှတ်မပြုနိုင်သောကြောင့် ကျွန်ုပ်တွင် excel output value ကို မူရင်းဒေတာအဖြစ် ရှိသည်။နမူနာများထည့်ခြင်း ပျက်ကွက်ခြင်း စသည်တို့ကဲ့သို့ ဒေတာကို အကြမ်းဖျင်းစိစစ်ခြင်းအား ဦးစွာလုပ်ဆောင်ရန် အကြံပြုအပ်ပါသည်။ အထွက်ဒေတာတွင် အမှတ်များကို ဖျက်ပစ်နိုင်သည် (ဟုတ်ပါတယ်၊ ၎င်းတို့ကို သင်ဖျက်၍မရပါ၊ LinRegPCR သည် နောက်ပိုင်းအဆင့်တွင် အဆိုပါအချက်များကို လျစ်လျူရှုပါမည်)

Fig5 qPCR ဒေတာတင်ပို့မှု

Fig6 ကိုယ်စားလှယ်လောင်းနမူနာရွေးချယ်ခြင်း။

ဒေတာထည့်သွင်းမှု-Open qualification amplification results.xls၊ → LinRegPCR → ဖိုင်ကိုဖွင့်ပါ → excel မှဖတ်ပါ → ပုံ 7 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း ဘောင်များကိုရွေးချယ်ပါ → OK → အခြေခံမျဥ်းကြောင်းများဆုံးဖြတ်ရန် ကိုနှိပ်ပါ

linRegPCR ဒေတာထည့်သွင်းမှု၏ Fig7 အဆင့်

ရလဒ်:ထပ်ခါတလဲလဲမရှိပါက အုပ်စုဖွဲ့ရန်မလိုအပ်ပါ။ထပ်ခါထပ်ခါရှိနေပါက၊ အုပ်စုဖွဲ့ခြင်းကို နမူနာအုပ်စုဖွဲ့ခြင်းတွင် တည်းဖြတ်နိုင်ပြီး မျိုးဗီဇအမည်ကို ခွဲခြားသတ်မှတ်မှုတွင် ထည့်သွင်းပြီးနောက် တူညီသောဗီဇကို အလိုအလျောက်အုပ်စုဖွဲ့မည်ဖြစ်သည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ ဖိုင်ကိုနှိပ်ပါ၊ excel တင်ပို့ပါ၊ ရလဒ်များကိုကြည့်ရှုပါ။ရေတွင်းတစ်ခုစီ၏ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်နှင့် R2 ရလဒ်များကို ပြသပါမည်။ဒုတိယအနေဖြင့်၊ အုပ်စုများခွဲထားလျှင် ပြုပြင်ထားသော ပျမ်းမျှချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို ပြသပါမည်။primer တစ်ခုစီ၏ ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်သည် 85% နှင့် 115% ကြားဖြစ်ကြောင်း သေချာပါစေ။ကြီးလွန်းလျှင် သို့မဟုတ် အလွန်သေးငယ်ပါက၊ primer ၏ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည် ညံ့ဖျင်းသည်ဟု ဆိုလိုသည်။

ပုံ 8 ရလဒ်နှင့် ဒေတာအထွက်

စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်-
RNA အရည်အသွေးလိုအပ်ချက်များ
သန့်ရှင်းမှု-၁.၇2.0 သည် အကြွင်းအကျန် isothiocyanate ဖြစ်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။သန့်စင်သော nucleic acid A260/A230 သည် 2 ဝန်းကျင်ဖြစ်သင့်သည်။ အကယ်၍ 230 nm တွင် စုပ်ယူမှုအားကောင်းပါက၊ phenate ions ကဲ့သို့သော အော်ဂဲနစ်ဒြပ်ပေါင်းများရှိကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။ထို့အပြင်၎င်းကို 1.5% agarose gel electrophoresis ဖြင့်ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်။ssRNA တွင် denaturation မရှိသည့်အပြင် မော်လီကျူးအလေးချိန် လော့ဂရစ်သမ်တွင် မျဉ်းကြောင်းဆက်နွယ်မှု မရှိသောကြောင့်၊ မော်လီကျူးအလေးချိန်ကို မှန်ကန်စွာ ဖော်ပြ၍မရသောကြောင့် အမှတ်အသားကို ညွှန်ပြသည်။အာရုံစူးစိုက်မှု- သီအိုရီအရမဟုတ်ဘူး100ng/ul ထက်နည်းသည်၊ အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းလွန်းပါက၊ သန့်ရှင်းမှုသည် ယေဘုယျအားဖြင့် နိမ့်သည်မဟုတ်ပေ။

Fig9 RNA ဂျယ်

ထို့အပြင်၊ နမူနာသည် အဖိုးတန်ပြီး RNA အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားပါက၊ ထုတ်ယူပြီးနောက် ၎င်းကို ဖယ်ထုတ်ရန် အကြံပြုထားပြီး၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းအတွက် RNA ကို နောက်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှု 100-300ng/ul တွင် အပျော့စားပြုလုပ်ရန် အကြံပြုထားသည်။၌reverse transcription လုပ်ငန်းစဉ်mRNA ကို ကူးယူဖော်ပြသည့်အခါ၊ polyA အမြီးများနှင့် အတိအကျ ချည်နှောင်နိုင်သော oligo (dt) primer များကို ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြခြင်းအတွက် အသုံးပြုကြပြီး၊ lncRNA နှင့် circRNA တို့သည် ကျပန်း hexamer (Random 6 mer) primer များကို အသုံးပြု၍ miRNA အတွက်၊ miRNA အတွက်၊ miRNA သီးသန့် လည်ပင်း-ကွင်းပတ် ကူးယူခြင်းအတွက် အသုံးပြုပါသည်။ယခုအခါ ကုမ္ပဏီများစွာသည် အထူးအနောက်တွဲကိရိယာများကို စတင်ထုတ်လုပ်နေပြီဖြစ်သည်။stem-loop method အတွက်၊ tailing method သည် ပိုအဆင်ပြေသည်၊ high-throughput, and reagent-saving, သို့သော် တူညီသော မိသားစု၏ miRNAs များကို ခွဲခြားခြင်း၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုမှာ stem-loop method လောက် မကောင်းသင့်ပါ။ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းကိရိယာတစ်ခုစီတွင် မျိုးရိုးဗီဇအလိုက် သီးသန့် primers (stem-loops) များ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုအတွက် လိုအပ်ချက်များရှိသည်။miRNA အတွက် အသုံးပြုသည့် အတွင်းပိုင်း အကိုးအကားမှာ U6 ဖြစ်သည်။stem-loop ပြောင်းပြန်လှန်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တွင်၊ U6 ၏ tube ကို သီးခြားပြောင်းပြန်လှန်သင့်ပြီး U6 ၏ ရှေ့နှင့်နောက် primers များကို တိုက်ရိုက်ထည့်သင့်သည်။circRNA နှင့် lncRNA နှစ်ခုလုံးသည် အတွင်းပိုင်းအကိုးအကားအဖြစ် HKGs ကို သုံးနိုင်သည်။၌cDNA ထောက်လှမ်းခြင်း၊
RNA ပြဿနာမရှိရင် cDNA လည်း ကောင်းသင့်တယ်။သို့သော်၊ စမ်းသပ်မှု၏ပြီးပြည့်စုံမှုကိုလိုက်လျှောက်ပါက၊ gDNA နှင့် cds တို့ကိုခွဲခြားနိုင်သော အတွင်းပိုင်းအကိုးအကားမျိုးဗီဇ (Reference gene, RG) ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။ယေဘူယျအားဖြင့် RG သည် အိမ်စောင့်ဗီဇတစ်ခုဖြစ်သည်။, HKG) ပုံ 10 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း;ထိုအချိန်တွင် ကျွန်ုပ်သည် ပဲပိစပ်သိုလှောင်မှုပရိုတင်းကို ပြုလုပ်နေပြီး အတွင်းပိုင်းအကိုးအကားအဖြစ် အင်ထရွန်ပါဝင်သော actin7 ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။gDNA ရှိ ဤ primer ၏ ချဲ့ထွင်ထားသောအပိုင်း၏ အရွယ်အစားသည် 452bp ဖြစ်ပြီး၊ cDNA ကို နမူနာအဖြစ် အသုံးပြုပါက၊ ၎င်းသည် 142bp ဖြစ်သည်။ထို့နောက် စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအရ cDNA ၏တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းသည် gDNA မှ အမှန်တကယ် ညစ်ညမ်းနေကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ ရလဒ်နှင့် ပြဿနာမရှိကြောင်း သက်သေပြခဲ့ပြီး ၎င်းကို PCR အတွက် နမူနာအဖြစ် အသုံးပြုနိုင်သည်။agarose gel electrophoresis ကို cDNA ဖြင့် တိုက်ရိုက်လုပ်ဆောင်ရန် အသုံးမ၀င်ပါ၊ ၎င်းသည် ယုံနိုင်စရာမရှိသော ပျံ့နှံ့နေသော တီးဝိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည်။

ပုံ 10 cDNA ထောက်လှမ်းခြင်း။

qPCR အခြေအနေများ ဆုံးဖြတ်ခြင်း။အဓိကအားဖြင့် tm တန်ဖိုးအဆင့်တွင် kit ၏ protocol အရ ယေဘုယျအားဖြင့် ပြဿနာမရှိပါ။အချို့သော primer များသည် primer ဒီဇိုင်းတွင် ကောင်းမွန်စွာ မဒီဇိုင်းထုတ်ထားပါက၊ tm value နှင့် theoretical 60°C အကြား ကြီးမားသော ခြားနားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပါက၊ cDNA နမူနာများကို ရောနှောပြီးနောက်၊ gradient PCR ကို primers ဖြင့် run ပြီး TM value အဖြစ် bands မပါဘဲ အပူချိန်ကို ရှောင်ရှားရန် ကြိုးစားပါ။

ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ

သမားရိုးကျ နှိုင်းရ fluorescence quantitative PCR လုပ်ဆောင်ခြင်းနည်းလမ်းသည် အခြေခံအားဖြင့် 2 အရဖြစ်သည်။-ΔΔCT.ဒေတာလုပ်ဆောင်ခြင်းပုံစံ။

ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်များ-

အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR လွယ်ကူသည်။^TM - တက်ခ်မန်

အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR လွယ်ကူသည်။^TM -SYBR Green I

RT Easy I (ပထမကြိုးမျှင် cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက် Master Premix)

RT Easy II (qPCR အတွက် ပထမဆုံး cDNA ပေါင်းစပ်မှုအတွက် Master Premix)