ခြုံငုံသုံးသပ်ချက်
မျိုးရိုးဗီဇအပင်များကို အမြန်ဖော်ထုတ်ခြင်း။
စာသား/Tong Yucheng
စမ်းသပ်လည်ပတ်မှု/ဟန်ယင်
တည်းဖြတ်သူ/Wen Youjun
စာလုံးရေ/1600+
အကြံပြုထားသော စာဖတ်ချိန်/ 8-10 မိနစ်
မျိုးရိုးဗီဇအပင်များကို အမြန်ဖော်ထုတ်ခြင်း။
ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် အသစ်ဝင်လာသူအနေဖြင့် ပြောင်းနှုန်းနည်းသော အပင်အစုအဝေးမှ အပြုသဘောဆောင်သောအပင်များကို စစ်ဆေးရန်မှာ ကောင်းသောအလုပ်မဟုတ်ပါ။ပထမဦးစွာ DNA ကိုနမူနာအမြောက်အမြားမှတစ်ခုပြီးတစ်ခုထုတ်ယူရမည်ဖြစ်ပြီး၊ ထို့နောက်နိုင်ငံခြားမျိုးဗီဇများကို PCR မှရှာဖွေတွေ့ရှိမည်ဖြစ်သည်။သို့သော်၊ ရလဒ်များသည် ရံဖန်ရံခါတွင် ပစ္စည်းအနည်းငယ်ပါသော ကွက်လပ်များနှင့် ကြိုးဝိုင်းများ ဖြစ်လေ့ရှိသော်လည်း လွတ်သွားသော ထောက်လှမ်းမှုများ သို့မဟုတ် မှားယွင်းသော ထောက်လှမ်းမှုများ ရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန် မဖြစ်နိုင်ပေ။.ထိုသို့သော စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်နှင့် ရလဒ်များကို ရင်ဆိုင်ရန် အလွန် အကူအညီမဲ့နေပါသလား။စိတ်မပူပါနဲ့၊ ညီလေး က transgenic positive အပင်တွေကို လွယ်လွယ်ကူကူနဲ့ တိကျစွာ စစ်ဆေးနည်းကို သင်ပေးတယ်။
အဆင့် ၁: ဒီဇိုင်းထောက်လှမ်း primers
စမ်းသပ်မည့်နမူနာအရ တွေ့ရှိရမည့် endogenous gene နှင့် exogenous gene ကို ဆုံးဖြတ်ပြီး primer ဒီဇိုင်းအတွက် gene အတွက် ကိုယ်စားလှယ် 100-500bp sequence ကို ရွေးချယ်ပါ။ကောင်းသော primers များသည် ထောက်လှမ်းခြင်းရလဒ်များ၏ တိကျမှုကို သေချာစေပြီး ထောက်လှမ်းချိန်ကို တိုစေသည် (အသုံးများသော ထောက်လှမ်းရေး primers အတွက် နောက်ဆက်တွဲကို ကြည့်ပါ)။
မှတ်ချက် -
အသစ်ရေးဆွဲထားသော primers များသည် တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်လုပ်ပြီး အကြီးစားထောက်လှမ်းမှုမလုပ်ဆောင်မီ ထောက်လှမ်းမှု၏တိကျမှု၊ တိကျမှုနှင့် ထောက်လှမ်းမှုကန့်သတ်ချက်ကို စစ်ဆေးရန် လိုအပ်သည်။
အဆင့် 2-စမ်းသပ်ဆဲပရိုတိုကောကို တီထွင်ပါ။
အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှု- PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်နှင့် အခြေအနေများသည် ပုံမှန်ဟုတ်မဟုတ် ဆုံးဖြတ်ရန် ပစ်မှတ်အပိုင်းအစများပါရှိသော သန့်စင်ထားသော DNA ကို နမူနာပုံစံအဖြစ် အသုံးပြုပါ။
အနုတ်လက္ခဏာ/အလွတ် ထိန်းချုပ်မှု- DNA နမူနာပုံစံ သို့မဟုတ် ddH ကို အသုံးပြုပါ။2O သည် PCR စနစ်တွင် ညစ်ညမ်းမှု ရင်းမြစ်ရှိမရှိ စစ်ဆေးရန် ပုံစံပလိတ်အဖြစ် ပစ်မှတ်အပိုင်းအစများ မပါဝင်ပါ။
အတွင်းအကိုးအကားထိန်းချုပ်မှု- နမူနာ၏ endogenous gene ၏ primer/probe ပေါင်းစပ်မှုကို PCR မှရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်ရှိမရှိအကဲဖြတ်ရန် စမ်းသပ်ရန်အတွက် နမူနာကိုအသုံးပြုပါ။
မှတ်ချက် -
စမ်းသပ်မှုရလဒ်များ၏တရားဝင်မှုကိုအကဲဖြတ်ရန် စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီအတွက် အပြုသဘော၊ အနုတ်လက္ခဏာ/အလွတ်ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုထိန်းချုပ်မှုများကို သတ်မှတ်သင့်သည်။
အဆင့် ၃- စမ်းသပ်ပြင်ဆင်မှု
အသုံးမပြုမီ၊ ဖျော်ရည်သည် အညီအမျှရောစပ်မှုရှိမရှိ သတိပြုပါ။မိုးရွာသွန်းမှုတွေ့ရှိပါက အသုံးမပြုမီ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း အရည်ဖျော်ပြီး ရောစပ်ရပါမည်။2×PCR ရောနှောခြင်းကို အသုံးမပြုမီ ပိုက်ပိုက်ဖြင့် မိုက်ခရိုပီပက်နှင့် ထပ်ခါတလဲလဲ ရောစပ်ထားရန် လိုအပ်ပါသည်။
မှတ်ချက် -
ညွှန်ကြားချက်များကိုထုတ်ပြီး ၎င်းတို့ကို ဂရုတစိုက်ဖတ်ပါ၊ ညွှန်ကြားချက်များနှင့်အညီ တိကျသောစမ်းသပ်မှုမတိုင်မီ ကြိုတင်ပြင်ဆင်မှုများပြုလုပ်ပါ။
အဆင့် 4- PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကို ပြင်ဆင်ပါ။
စမ်းသပ်ဆဲပရိုတိုကောအရ primers, H2O၊ 2×PCR ရောနှော၊ ဗဟိုပြု၍ တုံ့ပြန်မှုပြွန်တစ်ခုစီသို့ ဖြန့်ဝေပါ။
မှတ်ချက် -
အကြီးစား သို့မဟုတ် ရေရှည်စမ်းသပ်ခြင်းအတွက်၊ PCR ထုတ်ကုန်များကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော aerosol ညစ်ညမ်းမှုကို ထိထိရောက်ရောက်ရှောင်ရှားနိုင်သည့် UNG အင်ဇိုင်းပါဝင်သော PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကို အသုံးပြုရန် အကြံပြုထားသည်။
အဆင့် 5- တုံ့ပြန်မှုပုံစံကို ထည့်ပါ။
Direct PCR နည်းပညာကို အသုံးပြု၍ ပျင်းစရာကောင်းသော နျူကလိယအက်ဆစ် သန့်စင်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွက် မလိုအပ်ပါ။နမူနာပုံစံပုံစံကို 10 မိနစ်အတွင်း ပြင်ဆင်နိုင်ပြီး သက်ဆိုင်ရာ PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်သို့ ထည့်သွင်းနိုင်သည်။
မှတ်ချက် -
Lysis နည်းလမ်းသည် ပိုမိုကောင်းမွန်သော ထောက်လှမ်းမှုအကျိုးသက်ရောက်မှုရှိပြီး ရရှိသောထုတ်ကုန်ကို ထောက်လှမ်းတုံ့ပြန်မှုများစွာအတွက် အသုံးပြုနိုင်သည်။
5.1- အရွက်၏ တိုက်ရိုက် PCR
လက်စွဲစာအုပ်ပါ ပုံ၏အရွယ်အစားအရ အချင်း ၂-၃ မီလီမီတာရှိသော အရွက်တစ်ရှူးကို ဖြတ်ပြီး PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် ထားရှိပါ။
မှတ်ချက်- အရွက်အပိုင်းအစများကို PCR တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်တွင် လုံးဝနှစ်မြှုပ်ထားကြောင်း သေချာစေပြီး အရွက်တစ်ရှူးများကို အလွန်အကျွံမထည့်ပါနှင့်။
5.2: အရွက် lysis နည်းလမ်း
အချင်း ၅-၇ မီလီမီတာ အချင်းရှိသော အရွက်တစ်ရှူးကို ဖြတ်ပြီး အာရုံခံပြွန်ထဲတွင် ထည့်ပါ။ရင့်ကျက်သောအရွက်ကို ရွေးချယ်ပါက အရွက်၏ပင်မသွေးကြောတစ်ရှူးများကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။Pipette 50ul Buffer P1 lysate ကို lysate သည် အရွက်တစ်ရှူးများကို လုံးလုံးလျားလျား နှစ်မြှုပ်နိုင်စေရန် သေချာစေရန်၊ ၎င်းကို အပူစက်ဘီး သို့မဟုတ် သတ္တုရေချိုးခန်းထဲတွင် ထားကာ 95°C တွင် lyse ကို 5-10 မိနစ်ကြာ ထားလိုက်ပါ။
50ul Buffer P2 neutralization ဖြေရှင်းချက်ကို ထည့်ပြီး ကောင်းစွာရောမွှေပါ။ရရှိလာသော lysate ကို ပုံစံပလိတ်တစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုနိုင်ပြီး PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် ထည့်သွင်းနိုင်သည်။
မှတ်ချက်- ပုံစံပလိတ်ပမာဏသည် PCR စနစ်၏ 5-10% အကြားဖြစ်သင့်ပြီး 20% ထက်မပိုသင့်ပါ (ဥပမာ၊ 20μl PCR စနစ်တွင်၊ 1-2μl ၏ lysis ကြားခံ၊ 4μl ထက်မပိုပါ)။
အဆင့် 6: PCR တုံ့ပြန်မှု
PCR တုံ့ပြန်မှုပြွန်ကို ဗဟိုပြု၍ ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် PCR ကိရိယာတစ်ခုတွင် ၎င်းတို့ကို ထားရှိပါ။
မှတ်ချက် -
တုံ့ပြန်မှုသည် အသံချဲ့စက်အတွက် သန့်စင်ခြင်းမရှိသော ပုံစံပလိတ်ကို အသုံးပြုသည်၊ ထို့ကြောင့် ချဲ့ထွင်ခြင်းစက်ဝန်းအရေအတွက်သည် သန့်စင်ထားသော DNA ပုံစံပလိတ်ကို အသုံးပြုသည့်အချိန်ထက် 5-10 လည်ပတ်မှုပိုများသည်။
အဆင့် 7: Electrophoresis ထောက်လှမ်းခြင်းနှင့် ရလဒ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
M:100bp DNA လှေခါး
1\4- သန့်စင်ထားသော DNA နည်းလမ်း
2\5- တိုက်ရိုက် PCR နည်းလမ်း
3\6- အလွတ်ထိန်းချုပ်မှု
အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု-
စမ်းသပ်မှုတွင် သတ်မှတ်ထားသော ထိန်းချုပ်မှုအမျိုးမျိုး၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်များသည် အောက်ပါအခြေအနေများနှင့် ကိုက်ညီသင့်သည်။မဟုတ်ပါက ပြဿနာ၏ အကြောင်းရင်းကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသင့်ပြီး ပြဿနာကို ဖယ်ရှားပြီးနောက် စမ်းသပ်မှုကို ထပ်မံပြုလုပ်သင့်သည်။
ဇယား 1။ ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုအမျိုးမျိုး၏ ပုံမှန်စမ်းသပ်မှုရလဒ်များ
* ပလတ်စမစ်ကို အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအဖြစ်အသုံးပြုသောအခါ၊ endogenous မျိုးဗီဇစမ်းသပ်မှုရလဒ်သည်အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်နိုင်သည်။
ရလဒ် စီရင်ချက်
A. နမူနာ၏ endogenous gene ၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်သည် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်ပြီး၊ သာမန် PCR ထောက်လှမ်းခြင်းအတွက် သင့်လျော်သော DNA ကို နမူနာမှ ထုတ်ယူ၍မရပါ သို့မဟုတ် ထုတ်ယူလိုက်သော DNA တွင် PCR တုံ့ပြန်မှုတားဆေးများပါရှိပြီး DNA ကို ထပ်မံထုတ်ယူသင့်သည်ဟု ညွှန်ပြပါသည်။
B. နမူနာ၏ endogenous gene ၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်သည် အပြုသဘောဖြစ်ပြီး၊ exogenous gene ၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်သည် အနုတ်လက္ခဏာဖြစ်ပြီး၊ သာမန် PCR ထောက်လှမ်းခြင်းအတွက် သင့်လျော်သော DNA ကို နမူနာမှ ထုတ်ယူပြီး နမူနာတွင် XXX ဗီဇကို စစ်ဆေးတွေ့ရှိခြင်းမရှိကြောင်း ဆုံးဖြတ်နိုင်သည်။
C. နမူနာ၏ endogenous gene ၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်သည် positive ဖြစ်ပြီး၊ exogenous gene ၏ စမ်းသပ်မှုရလဒ်သည် positive ဖြစ်ပြီး၊ သာမန် PCR ထောက်လှမ်းရန်အတွက် သင့်လျော်သော DNA ကို နမူနာမှ ထုတ်ယူထားပြီး၊ နမူနာ DNA တွင် XXX gene ပါရှိသည်။အတည်ပြုစမ်းသပ်မှုများကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။
အဆင့် 8: ထောက်လှမ်းရေး primers ဒီဇိုင်း
စမ်းသပ်ပြီးနောက်၊ ပတ်ဝန်းကျင်ညစ်ညမ်းမှုကို ကာကွယ်ရန် စမ်းသပ်ဧရိယာကို သုတ်ရန် 2% ဆိုဒီယမ် ဟိုက်ပိုကလိုရိုက်နှင့် 70% အီသနောရည်ကို အသုံးပြုပါ။
နောက်ဆက်တွဲ
ဇယား 2။ မျိုးဗီဇပြုပြင်ထားသောအပင်များ၏ ယေဘုယျ PCR ထောက်လှမ်းခြင်းအတွက် အသုံးများသော primers
ကိုးကားစာတမ်း-
SN/T 1202-2010၊ အစားအသောက်များတွင် မျိုးဗီဇပြုပြင်ထားသော အပင်ပါဝင်ပစ္စည်းများအတွက် အရည်အသွေးကောင်းမွန်သော PCR ထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်း။
စိုက်ပျိုးရေးဝန်ကြီးဌာန၏ ကြေညာချက် 1485-5-2010၊ မျိုးရိုးဗီဇ ပြုပြင်ထားသော အပင်များနှင့် ၎င်းတို့၏ ထုတ်ကုန်များ-ဆန် M12 နှင့် ၎င်း၏ ဆင်းသက်လာမှုများကို စမ်းသပ်ခြင်း။
စာတိုက်အချိန်- ဇွန်လ-၀၉-၂၀၂၁
