RT-qPCR သည် မော်လီကျူးဇီဝဗေဒ၏ အခြေခံစမ်းသပ်ချက်ဖြစ်ပြီး လူတိုင်းနှင့် ရင်းနှီးရမည်ဖြစ်သည်။၎င်းတွင် အဓိကအားဖြင့် အဆင့်သုံးဆင့်ပါဝင်သည်- RNA ထုတ်ယူခြင်း၊ cDNA သို့ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းနှင့် အချိန်နှင့်တပြေးညီ fluorescent quantitative PCR တို့ပါဝင်သည်။မကူညီဘူး၊ ဘာဖြစ်နေတာလဲ။၎င်းသည် ပြဿနာတစ်ခု ဖြစ်လာဖွယ်ရှိသည်။ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း စမ်းသပ်မှု!reverse transcription စမ်းသပ်မှုတွင် RNA၊ dNTP၊ primers နှင့် ထည့်ရန်သာ လိုအပ်သည်ဟု ထင်ရသော်လည်း၊ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းcentrifuge tube သို့ ကောင်းမွန်စွာ ရောမွှေပါ ၊ သို့သော် အမှန်တကယ် လည်ပတ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်တွင် ဂရုပြုရန် လိုအပ်သော အသေးစိတ်အချက်များစွာ ရှိပါသေးသည်။အဲဒါကို လေ့လာကြည့်ရအောင်။

RNA ၏အရည်အသွေးကိုမည်သို့စီရင်မည်နည်း။
cDNA ရရှိရန်၊ RNA အရည်အသွေးသည် အရေးကြီးပါသည်။RNA အရည်အသွေးကို အဓိကအားဖြင့် ရှုထောင့်နှစ်ခုမှ ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်-
(၁) RNA သမာဓိ၊Agarose gel electrophoresis ဖြင့် RNA ခိုင်မာမှုကို စစ်ဆေးနိုင်သည်။. ဥပမာတစ်ခုအနေဖြင့် ယူကရီရိုကိုယူ၍ ပြီးပြည့်စုံသော RNA တွင် ကြည်လင်ပြတ်သားသော ကြိုးသုံးချောင်းပါ၀င်သည်၊ ကြီးမှသေးငယ်သော မော်လီကျူးအလေးချိန်သည် 28S၊ 18S၊ နှင့် 5S၊ နှင့် 28S သည် 18S ထက် နှစ်ဆတောက်ပသည်။တီးဝိုင်းသုံးခုကို မြင်နိုင်သော်လည်း တီးဝိုင်းအမျိုးအစားသည် မှုန်ဝါးနေသည် သို့မဟုတ် ပျံ့နှံ့သွားပါက RNA သည် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ဆုတ်ယုတ်သွားသည်ဟု ဆိုလိုသည်။ဤအချိန်တွင်၊ ကျေးဇူးပြု၍ ကျေးဇူးပြု၍ ပြောင်းပြန်ကူးယူတုံ့ပြန်မှုကို ချက်ချင်းလုပ်ဆောင်ပြီး ပုံစံပလိတ်ထည့်သွင်းမှုကို သင့်လျော်စွာတိုးမြှင့်ပါ။သေးငယ်သော မော်လီကျူးအလေးချိန် သို့မဟုတ် တီးဝိုင်းမျှသာရှိသော တီးဝိုင်းတစ်ခုကိုသာ မမြင်နိုင်ပါက RNA သည် လုံးဝပျက်စီးသွားပြီး ပြန်လည်ထုတ်ယူရန် လိုအပ်သည်။Agilent 2100 သည် အထွတ်အထိပ် ပုံကြမ်းနှင့် RIN တန်ဖိုးဖြင့် RNA ၏ ခိုင်မာမှုကို ညွှန်ပြသည်။နျူကလိစ်အက်ဆစ်သည် နဂိုအတိုင်းရှိနေပါက၊ အီလက်ထရိုဖီရိုဂရမ်၏ အခြေခံမျဉ်းသည် ပြားချပ်ချပ်၊နျူကလိစ်အက်ဆစ်သည် ပြင်းထန်စွာ ဆုတ်ယုတ်သွားပါက အခြေခံလိုင်းသည် မညီမညာဖြစ်ပြီး ပိုမိုပြိုကွဲပျက်စီးမှု အထွတ်အထိပ်များ ပေါ်လာသည်။RIN ၏တန်ဖိုးသည် 0 မှ 10 အကွာအဝေးအတွင်း RNA ၏ခိုင်မာမှုကိုထင်ဟပ်သည်၊ တန်ဖိုးကြီးလေ၊ RNA ၏အရည်အသွေးပိုကောင်းလေဖြစ်သည်။ကောင်းပြီ၊ ပြီးပြည့်စုံမှုအဆင့်မြင့်လေလေ၊
(၂) RNA ၏သန့်ရှင်းမှု၊OD260/280 အချိုးကို UV spectrophotometry ဖြင့် သိရှိနိုင်သည်။OD260/280 ၏အချိုးသည် 1.9 နှင့် 2.1 အကြားဖြစ်ပါက၊ သန့်ရှင်းမှုသည် အလွန်ကောင်းမွန်ပါသည်။
ကျန်ရှိသော မျိုးရိုးဗီဇ DNA သည် မမှန်ကန်သော အရေအတွက်ရလဒ်များကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။
RNA ကို ထုတ်ယူသောအခါ၊ ကျွန်ုပ်တို့ရရှိသော RNA သည် မသန့်စင်ရသေးသော မျိုးရိုးဗီဇ DNA (gDNA) နှင့် ရောနှောသွားနိုင်သည်။ထို့ကြောင့်၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူပြီးနောက် cDNA ကိုလည်း ရောနှောသွားမည်ဖြစ်သည်။gDNA.ရေစုန်အတွင်းqPCRတုံ့ပြန်မှု၊cDNAနှင့် gDNA ကို တပြိုင်နက်တည်း ချဲ့ထွင်နိုင်ပြီး CT တန်ဖိုး အနည်းငယ်ကို ဖြစ်ပေါ်စေသောကြောင့် ရလဒ်များသည် ဘက်လိုက်နိုင်ပါသည်။
ဒါဆို ဒီအခြေအနေမှာ ငါတို့ ဘာလုပ်သင့်လဲ။Foregeneအကြံပြုသည်-
(1) RNA ထုတ်ယူနေစဉ်အတွင်း ကော်လံထုတ်ယူခြင်းဖြင့် ဖယ်ရှားနိုင်သည့် ပြောင်းပြန် RNA ပေါ်တွင် ဂျီနိုအာကို သန့်ရှင်းရေးလုပ်ဆောင်ပါ။
(၂) ထုတ်ယူထားသော RNA ကို DNase ဖြင့် ကုသပါ။I သို့သော် ၎င်းကို EDTA ဖြင့် အဆုံးသတ်ပါ။
reverse transcription reagents များဂျီနိုမ်ရှင်းလင်းရေး module များနှင့်အတူ ;

ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းအတွက် primer ကိုဘယ်လိုရွေးချယ်မလဲ။
Reverse transcription primers သည် reverse transcription reaction ၏ရလဒ်ကို သက်ရောက်မှုရှိပါသည်။စမ်းသပ်မှု၏ သီးခြားအခြေအနေများအလိုက် ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းအတွက် ကျပန်း primers၊ Oligo dT သို့မဟုတ် gene-specific primers ကို သင်ရွေးချယ်နိုင်သည်-
(၁) တိကျသောမှတ်တမ်းများ: မျိုးဗီဇဆိုင်ရာ သီးသန့် primers များကို အကြံပြုထားပါသည်။
(၂) ရှည်လျားသော စာသားမှတ်တမ်းများ: Oligo dT/ မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ သီးသန့် primers များကို အကြံပြုထားပါသည်။
(၃) ရှည်လျားသော အပိုင်းမှတ်တမ်းများ၏ အတွင်းပိုင်းအပိုင်းအစများ: မျိုးရိုးအလိုက် သီးသန့် primers/ ကျပန်း primers/random primers + Oligo dT။နောက်ဆက်တွဲ qPCR စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်ပါက၊ Oligo dT တစ်ခုတည်းကို အသုံးပြု၍မရပါ၊ Oligo dT တစ်ခုတည်းကို အသုံးပြုခြင်းသည် 3′ အဆုံးဘက်လိုက်မှုကို ဖြစ်စေနိုင်ပြီး တိကျသော qPCR စမ်းသပ်မှုရလဒ်များကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သောကြောင့်၊
(၄) miRNA: Stem-loop primers သို့မဟုတ် tailing primers ကိုသုံးနိုင်သည်။

ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြခြင်း ထုတ်ကုန် cDNA ကို အရေအတွက် မည်မျှ အကြိမ်ရေမှေးချသင့်သနည်း။
ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြခြင်း ထုတ်ကုန်၏ cDNA ကို ရရှိပြီးနောက်၊ qPCR စမ်းသပ်မှုများအတွက် cDNA ကို အကြိမ်မည်မျှ မှေးမှိန်သင့်သည် သည် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။cDNA အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားလွန်းပါက သို့မဟုတ် အလွန်နည်းပါက၊ ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်ကို ထိခိုက်နိုင်သည်။cDNA အာရုံစူးစိုက်မှုကို တိုင်းတာနိုင်သလား၊ ၎င်းကို မည်သို့လုပ်ဆောင်သင့်သနည်း။
(1) ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း ထုတ်ကုန်၏ cDNA အာရုံစူးစိုက်မှုကို တိုင်းတာ၍မရပါ၊ အကြောင်းမှာ cDNA ထုတ်ကုန်အပြင်၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းထုတ်ကုန်တွင် ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းကျန်ရှိသော Buffer၊ ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း၊ primers စသည်တို့ပါရှိသောကြောင့် အာရုံစူးစိုက်မှုတိုင်းတာခြင်းရလဒ်များကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပြီး OD260/280၊ OD260/ 230 နှင့် အချိုးအစားမှန်ကန်မှုမရှိပါ။ ထို့ကြောင့် CNA သည် ပုံမှန်မဟုတ်ပေ။ဤအချိန်တွင် အချို့သော မိတ်ဆွေများက သန့်စင်ပြီးနောက် အာရုံစူးစိုက်မှုကို တိုင်းတာမည်၊ဤတွင်၊ Foregene သည် cDNA ကို သန့်စင်ရန် အကြံပြုထားခြင်း မရှိကြောင်း သတိပေးလိုသည်မှာ၊ အကြောင်းမှာ ပြောင်းပြန်လှန်ခြင်းဖြင့် ရရှိသော cDNA ၏ကြာချိန်သည် မတူညီသောကြောင့်၊ သန့်စင်မှုတွင် တိုတောင်းသော cDNA ဆုံးရှုံးသွားမည်ဖြစ်သည်။
(၂) ဒါဆို ဘာလုပ်ရမလဲ။qPCR စမ်းသပ်မှုမပြုမီ၊ အကြိုစမ်းသပ်မှုမှတစ်ဆင့် cDNA ၏ အဖျော့ဖျော့ဖျော့ကို ဆုံးဖြတ်နိုင်သည်။ဥပမာ- qPCR စမ်းသပ်မှုများအတွက် နမူနာပုံစံများအဖြစ် cDNA စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်၊ 10-ဆ အရောအနှောနှင့် အဆ 100-အရည်ပျော်ခြင်းတို့ကို အသုံးပြုကာ 18-28 အကွာအဝေးရှိ CT တန်ဖိုးဖြင့် ဖျော့ဖျော့ကို ရွေးချယ်ပါ။

miRNA များကို မည်သို့ပြောင်းပြန် ကူးယူသင့်သနည်း။
miRNA သည် ပရိုတင်းအတွက် ကုဒ်မပါသော 22 nt ခန့်ရှိသော သေးငယ်သော သောင်တင်သည့် မော်လီကျူး RNA တစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်း၏တိုတောင်းသောအရှည်ကြောင့်၊ သမားရိုးကျ qPCR နည်းလမ်းသည် ၎င်းကို တိုက်ရိုက်ရေတွက်ရန် ခက်ခဲသောကြောင့် miRNA ကို မကြာခဏ တိုးချဲ့ရန် လိုအပ်ပါသည်။miRNA အတွက် အသုံးများသော reverse transcription method များတွင် stem-loop method နှင့် tailing method ပါဝင်သည်။
Stem-loop နည်းလမ်းသည် stem-loop primers များထည့်ခြင်းဖြင့် miRNA ကို တိုးချဲ့ရန်ဖြစ်သည်။ဤထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်းသည် အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် တိကျမှုပိုမိုမြင့်မားသော်လည်း ထောက်လှမ်းမှုနှုန်းမှာ နည်းပါးသည်။ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းတစ်ခုသည် miRNA တစ်ခုနှင့် အတွင်းပိုင်းကိုးကားချက်ကိုသာ ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်၊အမြီးထည့်ခြင်းနည်းလမ်းကို PolyA polymerase နှင့် reverse transcriptase ဖြစ်သည့် အင်ဇိုင်းနှစ်ခု၏ ပူးတွဲလုပ်ဆောင်ချက်ဖြင့် အပြီးသတ်သည်။PolyA polymerase သည် ၎င်း၏ အရှည်ကို တိုးမြှင့်ရန် miRNA သို့ PolyA အမြီးများ ပေါင်းထည့်ခြင်းအတွက် တာဝန်ရှိပြီး reverse transcriptase သည် ပြောင်းပြန် ကူးယူခြင်း တုံ့ပြန်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်။ဤနည်းလမ်းသည် မြင့်မားသော ထောက်လှမ်းမှုဆိုင်ရာ ပါ၀င်မှုရှိပြီး miRNA အများအပြားနှင့် အတွင်းအကိုးအကားများကို ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းတစ်ခုတွင် ရှာဖွေနိုင်သော်လည်း stem-loop နည်းလမ်းတွင် အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် တိကျမှုမှာ နည်းပါးပါသည်။