ထောက်လှမ်းမှု၏တိကျမှု
ကိစ္စအများစုတွင်၊ primer ဒီဇိုင်း၏ရည်ရွယ်ချက်သည် PCR ၏တိကျမှုကိုအမြင့်ဆုံးစေရန်ဖြစ်သည်။ကိန်းရှင်များစွာ၏ အနည်းနှင့်အများ ခန့်မှန်းနိုင်သော လွှမ်းမိုးမှုဖြင့် ၎င်းကို ဆုံးဖြတ်သည်။အရေးကြီးသောပြောင်းလဲမှုတစ်ခုသည် primer ၏ 3′အဆုံးရှိ sequence ဖြစ်သည်။
အရေးကြီးသည်မှာ၊ တိကျမှုအတွက် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော PCR စစ်ဆေးမှုများသည် ကျယ်ပြန့်သော ဒိုင်းနမစ်အကွာအဝေးထက် မြင့်မားသောစွမ်းဆောင်ရည်ကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားနိုင်ဖွယ်ရှိသည်။ အကြောင်းမှာ စစ်ဆေးမှုသည် သီးခြားမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်များကို မထုတ်လုပ်သောကြောင့်၊ ထို့ကြောင့် PCR ဓာတ်ပစ္စည်းများနှင့် ယှဉ်ပြိုင်ခြင်း သို့မဟုတ် ပင်မချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှုကို ဟန့်တားခြင်းဖြစ်သည်။
ဟုတ်ပါတယ်၊ အချို့သောကိစ္စများတွင်၊ တိကျသေချာမှုသည် အရေးအကြီးဆုံးမဟုတ်ပါ၊ ဥပမာအားဖြင့်၊ ရည်မှန်းချက်သည် အနီးကပ်ဆက်စပ်နေသည့်အတွက် ကွဲပြားသော်လည်း ရောဂါပိုးမွှားများကို တွက်ချက်ရန်၊ အထူးဒီဇိုင်း၊ ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ရန်နှင့် စိစစ်ရေးစံနှုန်းများ လိုအပ်ပါသည်။
အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးသည် အနည်းဆုံး ပစ်မှတ်တစ်ခုအား ချဲ့ထွင်ရန်ရှိမရှိ အနည်းဆုံးအားဖြင့် amplicons များ၏ တိကျမှုကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် စံနည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။သို့ရာတွင်၊ ဥပမာအားဖြင့်၊ ၎င်းတို့သည် သင့်လျော်သော primers များနှင့် ပုံစံပလိတ်ပါဝင်မှုနည်းသော ပေါင်းစပ်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကြောင့် ၎င်းတို့ကို ထိခိုက်စေနိုင်သောကြောင့် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးများကို အထင်မှားစေနိုင်ကြောင်း အလေးပေးရပါမည်။
P5 |အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးသည် ပစ်မှတ် DNA နှစ်ခု၏ မတူညီသောပမာဏကို ထောက်လှမ်းမှုနှစ်ခုမှရရှိသော Tm အပြောင်းအလဲများကို ပြသသည်။
A. ပိုမိုမြင့်မားသောပြင်းအား (ကြော်ငြာ) တွင်) qPCR တိုင်းတာမှုပြီးသောအခါတွင်ထင်ရှားသော primer dimer မရှိပါ။နမူနာပုံစံ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုမှာ ကော်ပီ 50 (င) သို့ လျော့ကျလာသည်နှင့်အမျှ၊ အတိအကျမဟုတ်သော ထုတ်ကုန်တစ်ခုသည် စတင်ပေါ်လာပြီး အနိမ့်ဆုံး အာရုံစူးစိုက်မှု (စ) တွင် တစ်ခုတည်းသော ထုတ်ကုန်ဖြစ်လာသည်။
B. စမ်းသပ်မှုတွင် တူညီသော Tms ကို ပစ်မှတ်အာရုံစူးစိုက်မှုအားလုံးတွင် မှတ်တမ်းတင်ခဲ့ပြီး အနိမ့်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှု (၅ စောင်)တွင်ပင် သိသာထင်ရှားသော primer dimer မရှိပါ။ဤထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်းနှစ်ခုကိုအသုံးပြုသောအခါ NTCs များတွင် ချဲ့ထွင်ခြင်းထုတ်ကုန်ကို ရှာမတွေ့ပါ။
P5 သည် ပုံစံပလိတ်တွင် မတူညီသော ပြင်းအားများ ရှိနေသည့်နမူနာများဖြင့် ရရှိသော ကွဲထွက်မှုမျဉ်းကွေးများကို ပြသသည်။P 5a သည် အနိမ့်ဆုံးပြင်းအား နှစ်ခုတွင်၊ ထုတ်လုပ်ထားသော သီးသန့်မဟုတ်သော အသံချဲ့စက်များ၏ Tms များသည် သီးခြား amplicons များထက် နိမ့်နေကြောင်း ပြသသည်။
သိသိသာသာ၊ အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသော ပစ်မှတ်များကို ထောက်လှမ်းရန် ဤရှာဖွေရေးနည်းလမ်းကို ယုံကြည်စိတ်ချစွာ အသုံးပြု၍မရပါ။
စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ NTCs၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ DNA လုံးဝမရှိသောနမူနာများသည် (တိကျသောမဟုတ်သော) အသံချဲ့စက်ထုတ်ကုန်များကို မှတ်တမ်းတင်မထားဘဲ၊ နောက်ခံမျိုးရိုးဗီဇ DNA သည် သီးခြားမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်ခြင်း/ပိုလီမာပြုလုပ်ခြင်းတွင် ပါဝင်နိုင်သည်ကို ညွှန်ပြပါသည်။
တစ်ခါတစ်ရံတွင် ထိုကဲ့သို့သော နောက်ခံ primers နှင့် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ပြုပြင်၍မရသော်လည်း မည်သည့် template concentration နှင့် NTC (P 5b) တွင် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုမပါဝင်သည့် ထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်းကို မကြာခဏ ဒီဇိုင်းဆွဲရန် ဖြစ်နိုင်သည်။
ဤနေရာတွင်၊ ပစ်မှတ်အာရုံစူးစိုက်မှုကို Cq 35 ဖြင့် ချဲ့ထွင်ခြင်းအား မှတ်တမ်းတင်ခြင်းသည်ပင် တိကျသော dissolution မျဉ်းကွေးကို ထုတ်ပေးလိမ့်မည်။အလားတူ၊ NTCs များသည် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုလက္ခဏာများ မပြပါ။တစ်ခါတစ်ရံတွင်၊ ထောက်လှမ်းခြင်းအပြုအမူသည် မိခင်အရက်ပေါ်တွင်မူတည်နိုင်ပြီး မတူညီသော Mg2+ ပြင်းအားများနှင့် ဆက်စပ်နိုင်သည့် အချို့သောကြားခံပေါင်းစပ်မှုများတွင် တိကျသောမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကိုသာ တွေ့ရှိနိုင်သည်။
ထောက်လှမ်းတည်ငြိမ်မှု
Ta ကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းသည် qPCR ထောက်လှမ်းခြင်း၏ empirical verification and optimization process တွင် အသုံးဝင်သော အဆင့်တစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်းသည် NTC ကိုချဲ့ထွင်ခြင်းမပြုဘဲ အနိမ့်ဆုံး Cq ကိုထုတ်ပေးသည့် အပူချိန် (သို့မဟုတ် အပူချိန်အကွာအဝေး) ကိုပြသခြင်းဖြင့် သတ်မှတ်ထားသော primer ၏ကြံ့ခိုင်မှုကို တိုက်ရိုက်ညွှန်ပြပေးပါသည်။
အာရုံခံနိုင်စွမ်းမှာ နှစ်ဆမှ လေးဆအထိ ကွာခြားချက်သည် mRNA ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှု မြင့်မားသောသူများအတွက် အရေးမကြီးနိုင်သော်လည်း ရောဂါရှာဖွေစမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ ၎င်းသည် အပြုသဘောနှင့် မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာရလဒ်များကြား ကွာခြားချက်ကို ဆိုလိုနိုင်သည်။
qPCR primers များ၏ Ta ဂုဏ်သတ္တိများသည် အလွန်ကွဲပြားနိုင်သည်။အချို့သောစမ်းသပ်မှုများသည် အလွန်ခိုင်ခံ့မှုမရှိသော်လည်း၊ ၎င်းတို့သည် primers ၏ အကောင်းဆုံး Ta တန်ဖိုးအောက်တွင် မလုပ်ဆောင်ပါက၊ ၎င်းတို့သည် လျင်မြန်စွာ ပြိုလဲသွားမည်ဖြစ်သည်။
ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုအမျိုးအစားသည် လက်တွေ့ကမ္ဘာတွင် မကြာခဏ ပြဿနာဖြစ်နေသောကြောင့် ၎င်းသည် အရေးကြီးပြီး နမူနာ၏သန့်ရှင်းမှု၊ DNA အာရုံစူးစိုက်မှု သို့မဟုတ် အခြား DNA ၏ပါဝင်မှုသည် အကောင်းဆုံးမဖြစ်နိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။
ထို့အပြင်၊ ပစ်မှတ်မိတ္တူအရေအတွက်သည် ကျယ်ပြန့်စွာကွဲပြားနိုင်ပြီး၊ ဓာတုပစ္စည်းများ၊ ပလပ်စတစ်အသုံးအဆောင်များ သို့မဟုတ် ကိရိယာများသည် စမ်းသပ်မှုစတင်သောအခါ အသုံးပြုသည့်အရာများနှင့် ကွဲပြားနိုင်သည်။
P6|အပူချိန် gradient သည် PCR ထောက်လှမ်းခြင်း၏ မတူညီသော ကြံ့ခိုင်မှုကို ပြသသည်။
A. လူ့ဦးနှောက် RNA မှပြင်ဆင်ထားသော cDNA တွင် PCR လုပ်ဆောင်ရန် Bioline ၏ Sensifast SYBR mastermix (ကတ်တလောက်နံပါတ် BIO-98050) ကို အသုံးပြုပါ။
B. Bio-Rad ၏ CFX qPCR တူရိယာကို အသုံးပြု၍ apalene ၏ ချဲ့ထွင်မှုမြေပုံနှင့် ပျော်ဝင်မှုမျဉ်းကြောင်း (NM_033207၊ F: GCCATGGAAGGAAAGTGACAGACC၊ R: CTCATGTGTGGGTGAATCTCCTAGG)။
C. ချဲ့ထွင်မှုဂရပ်နှင့် ACSBG1 ၏ အရည်ပျော်မျဉ်းကွေး (NM_015162.4၊ F: CTACACTTCCGGCACCACTGG၊ R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG)။
D. GFAP ၏ ချဲ့ထွင်မှု ဂရပ်နှင့် ဖျက်သိမ်းမှုမျဉ်းကွေး (NM_002055.5၊ F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC)။
E. Cqs သည် 7C အပူချိန် gradient အောက်တွင် မှတ်တမ်းတင်ထားသော Cq ၏ ခြားနားချက်ကို ပြသသည်။
P 6 သည် လူ့ဦးနှောက်နှင့်သက်ဆိုင်သော ဗီဇသုံးမျိုးအတွက် primers ကိုအသုံးပြု၍ qPCR မှ gradient Tas ကို 59C နှင့် 67C (P 6a) ကြားတွင် အသုံးပြုပြီး qPCR မှ မလိုလားအပ်သော စမ်းသပ်မှုတစ်ခု၏ ပုံမှန်ရလဒ်ကို ပြသသည်။
Opalin primers များသည် ၎င်းတို့၏ အကောင်းဆုံး Ta range သည် အလွန်ကျဉ်းမြောင်းသောကြောင့် (ပုံ 6b)၊ ဆိုလိုသည်မှာ Cqs သည် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ပြန့်ကျဲသွားသောကြောင့် Cqs သည် ၎င်းတို့၏ အကောင်းဆုံး Cqs Low နှင့် သိသိသာသာ နှိုင်းယှဉ်ခံရသောကြောင့် ဖြစ်သည်။
ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနည်းလမ်းသည် မတည်မငြိမ်ဖြစ်ပြီး အကောင်းမွန်ဆုံး ချဲ့ထွင်မှုဆီသို့ ဦးတည်သွားနိုင်သည်။ထို့ကြောင့် ဤ primer တစ်စုံကို ပြန်လည်ဒီဇိုင်းထုတ်သင့်သည်။ထို့အပြင်၊ Ta တစ်ခုစီ၏ အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးသည် ကွဲပြားသောကြောင့် ဤထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်း၏ တိကျမှုမှာလည်း ပြဿနာရှိနိုင်သည်ဟု အရည်ပျော်မျဉ်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (inset) က ပြသသည်။
P 6c တွင်ပြသထားသည့် ACSBG1 ထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်းသည် အထက်ဖော်ပြပါ Opalin ထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်းထက် ပိုမိုခိုင်မာသော်လည်း ၎င်းသည် စံနမူနာပြနှင့် ဝေးနေသေးပြီး ၎င်းကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင် ပြုလုပ်နိုင်ဖွယ်ရှိသည်။
သို့သော်၊ ခိုင်မာမှုနှင့် တိကျမှုကြားတွင် လိုအပ်သော ချိတ်ဆက်မှု မရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ အလေးပေးဖော်ပြသည်၊ အကြောင်းမှာ၊ ဤရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနည်းလမ်းမှ ထုတ်လုပ်သော dissolution curve သည် Tas (inset) အားလုံးတွင် တူညီသော peak value ကိုပြသသောကြောင့်ဖြစ်သည်။
အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ P 6d တွင်ပြသထားသည့် GFAP စမ်းသပ်မှုတွင်ပြသထားသည့်အတိုင်း Ts ၏ကျယ်ပြန့်သော Cqs ကိုထုတ်လုပ်ပေးသည့် ကြံ့ခိုင်မှုစမ်းသပ်မှုသည် ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိသည်။
တူညီသော 8 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်အကွာအဝေးတွင်ရရှိသော Cqs ၏ကွာခြားချက်မှာ 1 ထက်နည်းပြီး ပျော်ဝင်မှုမျဉ်းကွေး (inset) သည် ဤအပူချိန်အကွာအဝေးရှိ ထောက်လှမ်းမှုလက္ခဏာများကို အတည်ပြုသည်။တွက်ချက်ထားသော Tas နှင့် အမှန်တကယ် Ta အပိုင်းအခြားသည် အလွန်ကွာခြားနိုင်သည်ကို သတိပြုသင့်သည်။
သုတေသီများအား ထိရောက်သော primer များဒီဇိုင်းထုတ်ရာတွင် အထောက်အကူဖြစ်စေရန် လမ်းညွှန်ချက်များစွာရှိပါသည်၊ အများစုမှာ ကာလကြာရှည်တည်မြဲထားသောစည်းမျဉ်းများအပေါ်အခြေခံပြီး primers ၏ 3′အဆုံးအထိ အာရုံစိုက်မှုများစွာပြုလုပ်ထားသည်။3' အဆုံးတွင် G သို့မဟုတ် C နှင့် G သို့မဟုတ် C အခြေနှစ်ခု (GC ကုပ်ပါ) ကို ထည့်သွင်းရန် မကြာခဏ အကြံပြုလေ့ရှိသော်လည်း နောက်ဆုံး အခြေခံ 5 ခုမှ နှစ်ခုထက် မပိုစေရ။
လက်တွေ့တွင်၊ ဤစည်းမျဉ်းများသည် သုတေသီများကို လမ်းညွှန်နိုင်သော်လည်း ၎င်းတို့သည် အခြေအနေတိုင်းတွင် သေချာပေါက် မှန်ကန်နေမည်မဟုတ်ပေ။
P၇ |primer ၏ 3′ အဆုံးသည် တိကျမှု သို့မဟုတ် ထိရောက်မှုအပေါ် အနည်းငယ်သက်ရောက်မှုရှိသည်။
A. လူ့ HIF-1α (NM_181054.2) ဗီဇအတွက် ပရိုမိုးရှင်းများ၏ အနေအထား။
B. Agilent Brilliant III SYBR အစိမ်းရောင်မိခင်အရက် (ကြောင်နံပါတ် 600882) ကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်မှုခြောက်ခုကို ချဲ့ထွင်ပါ။
C. Bio-Rad ၏ CFX qPCR တူရိယာ နှင့် 3′ အဆုံး ပရိုမာများဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသော ချဲ့ထွင်မှု ဂရပ်နှင့် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေး။NTC များကို အနီရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။
D. စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီ၏ Cqs မှတ်တမ်း
ဥပမာအားဖြင့်၊ P 7 မှရလဒ်သည် 3′အဆုံးစည်းမျဉ်းနှင့်ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်သည်။ဒီဇိုင်းအားလုံးသည် အခြေခံအားဖြင့် တူညီသောရလဒ်များကို ထုတ်ပေးသည်၊၊ NTC တွင် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်စေသော primer ပေါင်းစပ်မှုနှစ်ခုသာရှိသည်။
သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် GC ကလစ်၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပံ့ပိုးမပေးနိုင်ပါ၊ အကြောင်းမှာ၊ ဤကိစ္စတွင်၊ အများဆုံး 30 အခြေကိုအသုံးပြုခြင်းသည် တိကျမှုကိုမလျှော့ချနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။
F primer သည် GGCC တွင်အဆုံးသတ်သည့် Test C သည် NTCs တွင် Cqs ကိုမှတ်တမ်းတင်ခဲ့ပြီး 30-အဆုံးတွင်ဤ sequences များကိုရှောင်ရှားလိုကြောင်းဖော်ပြသည်။primer pair တစ်ခု၏ အကောင်းဆုံး 3′end sequence ကို ဆုံးဖြတ်ရန် တစ်ခုတည်းသောနည်းလမ်းမှာ ကိုယ်စားလှယ်လောင်း primer အချို့ကို လက်တွေ့ကျကျ အကဲဖြတ်ရန်ဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ အလေးပေးဖော်ပြပါသည်။
ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်
အရေးကြီးသည်မှာ၊ အတိအကျမဟုတ်သော PCR ထောက်လှမ်းမှုသည် အတိအကျမဖြစ်နိုင်သော်လည်း အင်ဇိုင်း၊ မိခင်အရက်၊ ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများနှင့် စက်ဘီးစီးခြင်းအခြေအနေများကို ပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို အမျိုးမျိုးသောနည်းလမ်းများဖြင့် ချိန်ညှိကာ ချဲ့ထွင်နိုင်သည်။
PCR ထောက်လှမ်းခြင်း၏ ထိရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်၊ "စံမျဉ်းကွေးနည်းလမ်း" ဖြစ်သည့် ပစ်မှတ်နျူကလိစ်အက်ဆစ် 10 သို့မဟုတ် 5 ဆ ၏ အမှတ်စဉ်အရောအနှောကို အသုံးပြုခြင်းသည် အကောင်းဆုံးဖြစ်သည်။
စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုထုတ်လုပ်ရန် PCR amplicons သို့မဟုတ် ပေါင်းစပ် DNA ပစ်မှတ်များကို အသုံးပြုပါက၊ ဤပစ်မှတ်များ၏ အမှတ်စဉ်အရောအနှောများကို အဆက်မပြတ် နောက်ခံ DNA (မျိုးရိုးဗီဇ DNA ကဲ့သို့) နှင့် ရောနှောသင့်သည်။
P8 |PCR ၏ထိရောက်မှုကိုအကဲဖြတ်ရန် Dilution မျဉ်းကွေး။
A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA နှင့် R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC နှင့် Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (ကတ်တလောက်နံပါတ် 600882) အတွက် PCR နှင့် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးအခြေအနေများအတွက် အသုံးပြုပါ။
B. 100 ng RNA သည် ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြပြီး 2 ကြိမ် မှေးမှိန်သွားကာ စဉ်ဆက်မပြတ် ရောထားသော cDNA နမူနာများကို လူသား genomic DNA မှ 1 ng သို့ 5 ကြိမ် မှေးသွားသည်။အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးကို inset တွင်ပြသထားသည်။
C. ဒုတိယ cDNA နမူနာအတွက် RT တုံ့ပြန်မှု၊ ဖျော့ဖျော့နှင့် အမှတ်စဉ် အရောအနှောများကို ထပ်ခါတလဲလဲ ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ရလဒ်များသည် ဆင်တူသည်။
P 8 သည် မတူညီသော cDNA နမူနာနှစ်ခုတွင် တူညီသော ထောက်လှမ်းမှုနည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ စံမျဉ်းကွေးနှစ်ခုကို ပြသသည်၊ ရလဒ်သည် တူညီသောထိရောက်မှုဖြစ်ပြီး 100% ခန့်ရှိပြီး R2 တန်ဖိုးသည်လည်း အလားတူဖြစ်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ စမ်းသပ်ဒေတာနှင့် ဆုတ်ယုတ်မှုမျဉ်းကြားရှိ အံဝင်ခွင်ကျအဆင့် သို့မဟုတ် မျဉ်းဖြောင့်၏ ဒေတာဒီဂရီအကြား အံဝင်ခွင်ကျဖြစ်သည်။
စံမျဉ်းကွေးနှစ်ခုသည် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သော်လည်း အတိအကျတူညီမည်မဟုတ်ပါ။ရည်ရွယ်ချက်မှာ ပစ်မှတ်ကို တိကျစွာရေတွက်ရန်ဖြစ်ပါက၊ မသေချာမရေရာမှုကို ရှင်းပြခြင်းမရှိဘဲ မိတ္တူနံပါတ်တွက်ချက်ခြင်းအား လက်ခံနိုင်မည်မဟုတ်ကြောင်း မှတ်သားထားရပါမည်။
P9 |စံမျဉ်းကွေးကို အသုံးပြု၍ အရေအတွက် တိုင်းတာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသော မသေချာမှု.
A. PCR နှင့် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးအခြေအနေများကိုလုပ်ဆောင်ရန် GAPDH (NM_002046) အတွက် primers ကိုသုံးပါ။F- ACAGTTGCCATGTAGACC နှင့် R- TAACTGGTTGAGCACAGG နှင့် Bioline ၏ Sensifast SYBR mastermix (ကတ်တလောက်နံပါတ် BIO-98050)။
B. ချဲ့ထွင်မှုဇယား၊ အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးနှင့် Bio-Rad ၏ CFX qPCR တူရိယာဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသော စံမျဉ်းကွေး။
C. စံမျဉ်းကွေးဂရပ်နှင့် 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလ (CI)။
D. dilution မျဉ်းကွေးမှဆင်းသက်လာသော Cq တန်ဖိုးသုံးခု၏ မိတ္တူနံပါတ်နှင့် 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလ။
P 9 သည် ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ထားသော စမ်းသပ်မှုတစ်ခုအတွက်၊ စံမျဉ်းကွေးတစ်ခု၏ မွေးရာပါပြောင်းလဲမှုသည် ခန့်မှန်းခြေ 2 ဆ (ယုံကြည်မှု 95% ကြားကာလ၊ အနိမ့်ဆုံးမှ အမြင့်ဆုံး) ဖြစ်သည်၊ ၎င်းသည် မျှော်လင့်နိုင်သည့် အသေးငယ်ဆုံးပြောင်းလဲမှုဖြစ်နိုင်သည်။
ဆက်စပ်ထုတ်ကုန်-
တိရစ္ဆာန်တစ်ရှူး တိုက်ရိုက် PCR အစုံ
စာတိုက်အချိန်- စက်တင်ဘာ-၃၀-၂၀၂၁
