ကျွန်ုပ်တို့သည် အတွေ့အကြုံရှိသော ထုတ်လုပ်သူဖြစ်သည်။China High Sensitivity One-Step Probe Rt- လျှော့စျေးကြီးကြီးမားမားအတွက် ၎င်း၏စျေးကွက်၏ အရေးကြီးသော အသိအမှတ်ပြုလက်မှတ်များတွင် အများစုအနိုင်ရရှိခြင်း၊QpcrKit V2၊ အရည်အသွေးသည် စက်ရုံ၏ဘဝ၊ ဖောက်သည်၏လိုအပ်ချက်အပေါ် အာရုံစိုက်ခြင်းသည် ကုမ္ပဏီ၏ရှင်သန်မှုနှင့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု၏ရင်းမြစ်ဖြစ်သည်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရိုးသားမှုနှင့် ကောင်းမွန်သောယုံကြည်မှုဖြင့် အလုပ်လုပ်သောသဘောထားကို လိုက်နာသည်၊ သင်၏လာမည်ကို စောင့်မျှော်နေပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် အတွေ့အကြုံရှိသော ထုတ်လုပ်သူဖြစ်သည်။၎င်း၏စျေးကွက်၏အရေးကြီးသောအသိအမှတ်ပြုလက်မှတ်များတွင်အများစုအနိုင်ရတရုတ် Taq DNA Polymerase, Qpcr, ကျွန်ုပ်တို့၏ကုမ္ပဏီကတိများ: ကျိုးကြောင်းဆီလျော်စျေးနှုန်းများ, တိုတောင်းသောထုတ်လုပ်မှုအချိန်နှင့်စိတ်ကျေနပ်မှုပြီးနောက်-ရောင်းချဝန်ဆောင်မှု, ငါတို့သည်လည်းသင်တို့အလိုရှိသောအချိန်မရွေးကျွန်တော်တို့ရဲ့စက်ရုံသို့သွားရောက်ကြည့်ရှုဖို့ကြိုဆိုပါတယ်။သာယာပျော်ရွှင်ပြီး ရေရှည်လက်တွဲလုပ်ကိုင်နိုင်ပါစေလို့ ဆုတောင်းပေးလိုက်ပါတယ်!!!

ဖော်ပြချက်

ဤကိရိယာသည် RT-qPCR တုံ့ပြန်မှုများအတွက် ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာဆဲလ်နမူနာများမှ RNA ကို လျင်မြန်စွာထုတ်လွှတ်ပေးနိုင်သည့် ထူးခြားသော lysis ကြားခံစနစ်ကို အသုံးပြုထားပြီး၊ ထို့ကြောင့် အချိန်ကုန်ပြီး ပင်ပန်းခက်ခဲသော RNA သန့်စင်မှုလုပ်ငန်းစဉ်ကို ဖယ်ရှားပေးပါသည်။RNA နမူနာပုံစံကို 7 မိနစ်အတွင်း ရရှိနိုင်သည်။5×Direct RT Mix နှင့် 2×Direct qPCR Mix-SYBR ဓာတ်ပစ္စည်းများသည် အချိန်နှင့်တပြေးညီ အရေအတွက် PCR ရလဒ်များကို လျင်မြန်ထိရောက်စွာ ရရှိနိုင်ပါသည်။

5×Direct RT Mix နှင့် 2×Direct qPCR Mix-SYBR သည် ပြင်းထန်သော တားဆေးခံနိုင်ရည်ရှိပြီး၊ နမူနာများ၏ lysate ကို RT-qPCR အတွက် နမူနာပုံစံအဖြစ် တိုက်ရိုက်အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။ဤကိရိယာတွင် ထူးခြားသော RNA မြင့်မားသောဆက်စပ်မှုရှိသော Foregene reverse transcriptase နှင့် Hot D-Taq DNA polymerase၊ dNTPs၊ MgCl တို့ပါရှိသည်။₂တုံ့ပြန်မှုကြားခံ၊ PCR ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်လုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် တည်ငြိမ်မှု။

သတ်မှတ်ချက်များ

200×20μl Rxns၊ 1000×20μl Rxns

Kit အစိတ်အပိုင်းများ

အင်္ဂါရပ်များနှင့် အားသာချက်များ

■ ရိုးရှင်းပြီး ထိရောက်မှု - Cell Direct RT နည်းပညာဖြင့် RNA နမူနာများကို 7 မိနစ်အတွင်း ရရှိနိုင်သည်။

■ နမူနာလိုအပ်ချက်သည် သေးငယ်သည်၊ ဆဲလ် ၁၀ ခုအထိ စမ်းသပ်နိုင်သည် ။

■ မြင့်မားသောထွက်ရှိမှု- ၎င်းသည် 384၊ 96၊ 24၊ 12၊ 6- well plates များတွင် မွေးမြူထားသောဆဲလ်များတွင် RNA ကို လျင်မြန်စွာသိရှိနိုင်သည်။

■ DNA Eraser သည် ထွက်ရှိလာသော ဂျီနိုမ်များကို လျင်မြန်စွာ ဖယ်ရှားနိုင်ပြီး၊ နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအပေါ် သက်ရောက်မှုကို များစွာလျှော့ချနိုင်သည်။

■ Optimized RT နှင့် qPCR စနစ်သည် အဆင့်နှစ်ဆင့် RT-PCR ပြောင်းပြန်စာသားကို ပိုမိုထိရောက်စေပြီး PCR သည် ပိုမိုတိကျပြီး RT-qPCR တုံ့ပြန်မှုတားဆီးပေးသူများကို ပိုမိုခံနိုင်ရည်ရှိစေသည်။

Kit လျှောက်လွှာ

အသုံးချမှုနယ်ပယ်- မွေးမြူထားသောဆဲလ်များ။

- နမူနာ lysis မှထုတ်လွှတ်သော RNA- ဤကိရိယာ၏ RT-qPCR နမူနာပုံစံအတွက်သာ သက်ဆိုင်ပါသည်။

- အစုံအလင်ကို အောက်ပါရည်ရွယ်ချက်များအတွက်အသုံးပြုနိုင်သည်- မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ siRNA-mediated gene silencing effect၊ ဆေးစစ်ခြင်းစသည်ဖြင့်။

ပုံကြမ်း

သိုလှောင်မှုနှင့် စင်သက်တမ်း

ဤကိရိယာ၏ အပိုင်း I ကို 4 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းသင့်သည်။အပိုင်း II ကို -20 ℃ တွင်သိမ်းဆည်းထားသင့်သည်။

Foregene Protease Plus II ကို 4 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းထားသင့်ပြီး -20 ℃ တွင် အေးခဲမနေသင့်ပါ။

Reagent 2× Direct qPCR Mix-SYBR ကို အမှောင်ထဲတွင် -20 ℃ တွင် သိမ်းဆည်းထားသင့်သည်။မကြာခဏအသုံးပြုပါက၊ ၎င်းကိုရေတိုသိုလှောင်မှုအတွက် 4 ℃ (10 ရက်အတွင်းအသုံးပြုနိုင်သည်)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် အတွေ့အကြုံရှိသောထုတ်လုပ်သူဖြစ်သည်။Wining the majority in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Quality is factory' life , Focus on customer' demand is the source of company survival and development, We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
လျှော့စျေးကြီးတရုတ် Taq DNA Polymerase, Qpcr, ကျွန်ုပ်တို့၏ကုမ္ပဏီမှကတိပြုသည်: ကျိုးကြောင်းဆီလျော်စျေးနှုန်းများ, တိုတောင်းသောထုတ်လုပ်မှုအချိန်နှင့်စိတ်ကျေနပ်မှုပြီးနောက်-ရောင်းချဝန်ဆောင်မှု, ငါတို့သည်လည်းသင်တို့အလိုရှိသောအချိန်မရွေးကျွန်တော်တို့ရဲ့စက်ရုံသို့သွားရောက်ကြည့်ရှုဖို့ကြိုဆိုပါတယ်။သာယာပျော်ရွှင်ပြီး ရေရှည်လက်တွဲလုပ်ကိုင်နိုင်ပါစေလို့ ဆုတောင်းပေးလိုက်ပါတယ်!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

ဆဲလ်တိုက်ရိုက် RT-qPCR အတွက် ≤ 1000,000 ဆဲလ်များကို အသုံးပြုသည်။

ထုတ်ကုန်မိတ်ဆက်

ဤထုတ်ကုန်သည် RT-qPCR တုံ့ပြန်မှုများအတွက် ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာဆဲလ်နမူနာများမှ RNA ကို လျင်မြန်စွာထုတ်လွှတ်ပေးရန်၊ အချိန်ကုန်ပြီး ပင်ပန်းခက်ခဲကြမ်းတမ်းသော RNA သန့်စင်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို ဖယ်ရှားကာ လိုအပ်သော RNA ပုံစံပုံစံကိုရရှိရန် 7 မိနစ်သာ အချိန်ပေးကာ 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman မှ ပံ့ပိုးပေးသော အချိန်နှင့် ထိရောက်မှုမှန်ကန်သော PCR ရလဒ်များကို လျင်မြန်စွာရရှိနိုင်သည်။

5× Direct RT Mix နှင့် 2× Direct qPCR Mix-Taqman သည် ပြင်းထန်သော တားဆေးသည်းခံနိုင်စွမ်းရှိပြီး နမူနာအဖြစ် တိုင်းတာရန် နမူနာ၏ lysate ကို အသုံးပြု၍ ထိရောက်သော ပြောင်းပြန်လှန်မှုနှင့် သီးခြားချဲ့ထွင်မှုကို လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။ဓာတ်ပစ္စည်းများတွင် Foregene Reverse Transcriptase၊ Hot D-Taq DNA Polymerase၊ dNTPs၊ MgCl တို့ပါရှိသည်။₂နမူနာများကို လျင်မြန်လွယ်ကူစွာ သိရှိနိုင်စေရန်၊ Reaction Buffer၊ PCR Optimizer နှင့် Stabilizer၊ နမူနာများကို လျင်မြန်လွယ်ကူစွာ ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်ပြီး မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်း၊ တိကျမှုနှင့် တည်ငြိမ်မှုဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများရှိသည်။

ထုတ်ကုန်အင်္ဂါရပ်များ

ရိုးရှင်းပြီး ထိရောက်သော Cell Direct RT နည်းပညာသည် RNA နမူနာများရရှိရန် 7 မိနစ်သာကြာသည်။

နမူနာလိုအပ်ချက်များသည် သေးငယ်ပြီး စမ်းသပ်မှုတွင် အနည်းဆုံး မွေးမြူထားသောဆဲလ် 10 ကို အသုံးပြုနိုင်သည်။

384၊ 96၊ 24၊ 12 နှင့် 6- well plates ကဲ့သို့သော ယဉ်ကျေးမှုဆဲလ်များ၏ လျင်မြန်သော RNA ရယူမှုအတွက် မြင့်မားသော ပမာဏ။

DNA Eraser သည် ထုတ်လွှတ်သော ဂျီနိုမ်များကို လျင်မြန်စွာ ဖယ်ရှားနိုင်ပြီး၊ နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအပေါ် သက်ရောက်မှုကို အလွန်လျှော့ချနိုင်သည်။

ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ထားသော RT နှင့် qPCR စနစ်များသည် နှစ်ဆင့် RT-PCR ကို ပိုမိုထိရောက်သော ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြမှု၊ တိကျမှု၊ နှင့် ပိုမိုအားကောင်းသော RT-qPCR တုံ့ပြန်မှုတားစီးခြင်းခံနိုင်ရည်ဖြင့် လုပ်ဆောင်ပေးပါသည်။

Kit လျှောက်လွှာ

အသုံးချမှုနယ်ပယ်- မွေးမြူထားသောဆဲလ်များ။

နမူနာ lysis သည် RNA ကို ဘာသာပြန်သည်- အဆင့်နှစ်ဆင့် RT-qPCR နမူနာအဖြစ်သာ အသုံးပြုသည်။

အစုံအလင်ကို အောက်ပါရည်ရွယ်ချက်များအတွက် သုံးနိုင်သည်- မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာ စည်းကမ်းဖော်ပြမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း၊ allele စမ်းသပ်ခြင်း၊ ဆေးစစ်ခြင်း စသည်တို့။

Kit ကန့်သတ်ချက်များ

ချဲ့ထားသောအပိုင်းအစများ ≤ 300 bp။

Kit များကို လတ်လတ်ဆတ်ဆတ် မွေးမြူထားသောဆဲလ်များအတွက် အသုံးပြုသည်။

ထုတ်ကုန်အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု

FOREGENE ၏စုစုပေါင်းအရည်အသွေးစီမံခန့်ခွဲမှုစနစ်အရ၊ Cell Direct RT-qPCR စီးရီးအစုံအစီအသုတ်တစ်ခုစီသည် အစုံလိုက်အသုတ်များ၏ အရည်အသွေးနှင့် တည်ငြိမ်မှုကို သေချာစေရန်အတွက် အကြိမ်ပေါင်းများစွာ ပြင်းပြင်းထန်ထန်စမ်းသပ်ထားသည်။

Kit အကြောင်းအရာများ

*:Cell Lysis၊ 5×Direct RT Mix၊ 2× Direct qPCR Mix-Taqman ကို သီးခြားစီ ဝယ်ယူနိုင်ပြီး အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို နောက်ဆက်တွဲ 1 (PAGE 13) တွင် ဖော်ပြထားသည်။

သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ

1. ပို့ဆောင်မှုအခြေအနေများ

ကိရိယာအစုံသည် <4°C အနေအထားတွင် ရှိနေကြောင်း သေချာစေရန် အပူချိန်နိမ့် ရေခဲသေတ္တာ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေး လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုလုံး။

2. သိုလှောင်မှုအခြေအနေများ

အပိုင်း I တွင် 4°C နှင့် Part II တွင် -20°C တွင် သိမ်းဆည်းပါ။

Foregene Protease Plus II ကို 4°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသင့်ပြီး -20°C တွင် အေးခဲခြင်းမရှိပါ။

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman ကို -20°C သို့မဟုတ် 4°C တွင် မကြာခဏအသုံးပြုပါက (၁၀ ရက်အတွင်း) ကာလတိုအသုံးပြုရန်အတွက် သိမ်းဆည်းထားသည်။

Kit အစိတ်အပိုင်းအချက်အလက်

Buffer CL- ဆဲလ် lysis တုံ့ပြန်မှုအတွက် လိုအပ်သော ပတ်ဝန်းကျင်ကို ပံ့ပိုးပေးသည်။

Buffer ST- နောက်ဆက်တွဲ RT အပေါ်သက်ရောက်မှုများကိုရှောင်ရှားရန် lysate အတွင်းရှိတက်ကြွသောဒြပ်စင်ကိုရပ်စဲသည်။

DNA Eraser- DNA ဖယ်ရှားရေး၊ နောက်ဆက်တွဲစမ်းသပ်မှုများတွင် ဂျီနိုမ်ကို ဖယ်ရှားခြင်း၏အကျိုးသက်ရောက်မှု။

5× Direct RT ရောနှော- အကောင်းဆုံး ချိန်ညှိမှုအတွက် RNA မြင့်မားသော Foregene Reverse Transcriptase၊ RNase Inhibitor၊ dNTPs၊ stabilizers၊ enhancers၊ optimizers နှင့် reverse transcription primer များ ပါဝင်သည် (ကျပန်း Primer၊ Oligo(dT)₁₈Primer)။

Foregene Protease Plus II- lysis ကြားခံအခြေအနေတွင်၊ ဆဲလ်များသည် nucleic acids များကိုထုတ်လွှတ်ရန် lysed ဖြစ်နေသည်။

2× Direct qPCR ရောစပ်-Taqman- ဤဓာတ်ပစ္စည်းများတွင် Hot D-Taq DNA Polymerase၊ dNTPs၊ MgCl ပါဝင်သည်₂တုံ့ပြန်မှုကြားခံ၊ PCR ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်လုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် တည်ငြိမ်မှု။

20× ROX ရည်ညွှန်းဆိုးဆေး- ABI၊ Stratagene နှင့် အခြားကုမ္ပဏီများ၏ အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR ချဲ့ထွင်သည့်ကိရိယာများတွင် ယေဘုယျအားဖြင့်အသုံးပြုသည်၊ ၎င်းကို PCR ပြွန်များနှင့် PCR ဆေးထိုးအမှားများကြောင့်ဖြစ်ရသည့် ပြွန်များကြား ကွာခြားချက်ကို ချိန်ညှိရန်အတွက် အသုံးပြုသည်။မတူညီသောတူရိယာများအတွက် လိုအပ်သော 20× ROX ရည်ညွှန်းဆိုးဆေး၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် ကွဲပြားပြီး အသုံးပြုသူသည် အကြံပြုထားသည့် တူရိယာ၏အာရုံစူးစိုက်မှုအရ ၎င်းကို ထည့်သွင်းနိုင်သည်။

RNase-Free ddH₂O- အဆင့်နှစ်ဆင့် RT-qPCR တုံ့ပြန်မှုအတွက် RNase-ကင်းစင်သော အထူးသန့်စင်သောရေ။

ကြိုတင်သတိပေးချက်များ:(ပစ္စည်းအစုံအလင်ကို အသုံးမပြုမီ သတိထားရမည့်အချက်များကို သေချာဖတ်ပါ)

နမူနာများကြားတွင် ညစ်ညမ်းမှုကို ရှောင်ရှားရန် စမ်းသပ်မှု၏ လုပ်ဆောင်ချက်နည်းလမ်းကို ဂရုပြုပါ။

RNase ညစ်ညမ်းမှုနှင့် RNA ပျက်စီးမှုကို ရှောင်ရှားရန် စမ်းသပ်ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် အသုံးအဆောင်များ၏ သန့်ရှင်းမှုကို ဂရုပြုပါ။

လတ်ဆတ်သော သို့မဟုတ် ကောင်းမွန်စွာ ထိန်းသိမ်းထားသော ဆဲလ်နမူနာများကို ယူ၍ ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲထားသော သုတ်ထားသော ဆဲလ်နမူနာများကို ဘယ်တော့မှ မသုံးပါနှင့်။

5× Direct qPCR Mix၊2× Direct qPCR Mix-Taqman သည် ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲနေသော အေးခဲခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်သင့်သည်၊ သို့မဟုတ်ပါက ၎င်းသည် ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းနှင့် PCR ထိရောက်မှုကို ထိခိုက်စေမည်ဖြစ်သည်။

ပြင်ဆင်ပါ။ရိက္ခာမီစစ်ဆင်ရေး

ဤကိရိယာကို အသုံးမပြုမီ ညွှန်ကြားချက်များကို သေချာဖတ်ပါ။Cell Direct RT-qPCR Kit သည် ရိုးရှင်း၊ အဆင်ပြေပြီး လည်ပတ်ရန် မြန်ဆန်ပြီး လမ်းညွှန်ချက်များသည် အစုံအလင်တစ်ခုလုံးနှင့် ပတ်သက်သော အချက်အလက်အပြည့်အစုံနှင့် ၎င်းကို မှန်ကန်စွာအသုံးပြုပုံတို့ကို ပေးပါသည်။အသုံးမပြုမီ လိုအပ်သော စမ်းသပ်ပစ္စည်းများနှင့် စက်ပစ္စည်းများကို ပြင်ဆင်ပါ။

စမ်းသပ်ပစ္စည်းများနှင့် ပစ္စည်းကိရိယာများ

◆ ယဉ်ကျေးမှုဆဲလ်များ။

◆ 1.5 ml သို့မဟုတ် 2 ml၊ RNase-/DNase-Free centrifuge tube၊ RNase-/DNase-Free tip၊ 0.2 ml မြုံ qPCR ပြွန်။

◆ qPCR စက်၊ pipette၊ tabletop centrifuge (≥၁၃၄၀၀×g) (စမ်းသပ်မှုလိုအပ်ချက်ပေါ်မူတည်၍) စသည်တို့။

ဘေးကင်းရေး

◆ ဤထုတ်ကုန်သည် သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသန ရည်ရွယ်ချက်အတွက်သာဖြစ်ပြီး ဆေးဝါး၊ ဆေးခန်း၊ အစားအစာနှင့် အလှကုန် ရည်ရွယ်ချက်များအတွက် မသုံးပါနှင့်။

◆ ဓာတုပစ္စည်းများအသုံးပြုသည့်အခါ သင့်လျော်သောဓာတ်ခွဲခန်းအဝတ်အစားများ၊ လက်အိတ်များ၊ အကာအကွယ်မျက်မှန်များ စသည်တို့ကို ဝတ်ဆင်ပါ။

လည်ပတ်မှုလမ်းပြများ

Cell Lysis စနစ်များ၊ RT စနစ်များနှင့် qPCR တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက် ဖြည့်စွက်စာများကို နောက်ဆက်တွဲ 1 (စာမျက်နှာ 13) တွင် အသေးစိတ်အတွက် သီးခြားဝယ်ယူနိုင်ပါသည်။

လည်ပတ်လမ်းညွှန်

A: နမူနာ RNA ထုတ်လွှတ်မှု

1. ဆဲလ်များကို ကြိုတင် ပြုပြင်ထားသည်- ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပန်းကန်ကို အအေးဖြင့် PBS ဖြင့် ဆေးကြောပြီးနောက် ဆဲလ်များကို ဆီသတ်ပါ (10-10⁶) ၁၀⁶ ဆဲလ်ပမာဏထက်၊ RNA ထုတ်ယူမှုနှင့် သန့်စင်မှုအတွက် စုစုပေါင်း (DE-03111) သို့မဟုတ် ဆဲလ်များ၏ Foregene the Cell an RNA Isolation Kit ကို အကြံပြုထားသည်။

၁.၁။တွယ်ဆက်ဆဲလ်များ (ဥပမာတစ်ခုအနေဖြင့် ၂၄-ရေတွင်းပန်းကန်)

၁.၁.၁။ရေတွင်းတစ်ခုစီရှိ ဆဲလ်အရေအတွက်ကို ဆုံးဖြတ်ပါ၊ ဆဲလ်အရေအတွက်သည် 1×10 ဖြစ်ကြောင်း ဆုံးဖြတ်ပါ။⁵၊ နှင့် ယဉ်ကျေးမှု ပန်းကန်ပြားမှ ယဉ်ကျေးမှုကြားခံကို ဖယ်ရှားရန် pipette ကို အသုံးပြုပါ။

၁.၁.၂။အအေးခံထားသော 1×PBS 200 μl ကို ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် ထည့်ပါ။အကြိမ်ကြိမ်ပိုက်မချပါနှင့် PBS ကို ရေတွင်းမှဖယ်ရှားပါ။ပန်းကန်ပြားကိုစောင်းပြီး PBS တတ်နိုင်သမျှဖယ်ရှားပါ။အဆင့် 2 ကိုဆက်ပါ။

၁.၁.၃။မတူညီသောဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပန်းကန် သို့မဟုတ် ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပန်းကန်တစ်ခုတွင် ရည်ညွှန်းနံပါတ်ဇယား 1-1 ကို ဆဲလ်ဆေးကြောရန်အတွက် ကြိုတင်အအေးခံထားသော 1 × PBS ကို ထည့်ထားသည်။

Table1-1- မတူညီသောဆဲလ်အရေအတွက်များအတွက် PBS သောက်သုံးမှု

မှတ်ချက်:ဆဲလ်များ ခိုင်မြဲစွာ တွယ်ကပ်မှု ရှိစေရန်၊ရေချိုးတဲ့အခါ ဆဲလ်အများအပြား ဆုံးရှုံးခြင်းကို ရှောင်ရှားနိုင်ပါတယ်။

၁.၂။Suspension ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် အပေါက်မရှိသော ပန်းကန်ပြားများတွင် မွေးမြူထားသော ဆက်စပ်ဆဲလ်များ

၁.၂.၁။အများအပြားမဟုတ်သော ပန်းကန်ပြားများတွင် တွယ်ဆက်ထားသောဆဲလ်များ (ဆိုင်းထိန်းဆဲလ်များကို နောက်အဆင့် 1.2.2 မှ စတင်သည်)၊ ပုံမှန်ဆဲလ်စုဆောင်းမှုနည်းလမ်းအရ ဆဲလ်များကို စုစည်းကာ ခွဲထုတ်ကာ ၎င်းတို့ကို ယဉ်ကျေးမှုပန်းကန်ပြား သို့မဟုတ် အာရုံခံပြွန်တစ်ခုအတွင်း ထားရှိပါ။trypsinization ကိုအသုံးပြုပါက၊ ဆဲလ်များကိုစုဆောင်းရန် centrifugation လိုအပ်ပြီး ကျန်ရှိသော trypsin ကိုဖယ်ရှားရန်၊ ဆဲလ်များကိုခွဲထုတ်ရန်အတွက် PBS resuspended cells များကို ဆဲလ်တစ်ခုချင်းစီသို့ ပေါင်းထည့်သည်။

၁.၂.၂။ဆဲလ်အရေအတွက်ကို ရေတွက်ပြီးနောက်၊ ခွဲထားသောဆဲလ်များသည် 1×10 ဖြစ်သည်။⁵ တစ်ခုမှ centrifuge ပြွန်များဆီသို့ 10 မိနစ်ကြာ 1000 × g တွင် centrifugation ဖြင့် ဆဲလ်များကို စုဆောင်းပါ။

၁.၂.၃။200 μl PBS ကို centrifuge tube ထဲသို့ထည့်ပါ၊ ထပ်ခါတလဲလဲပိုက်မချပါနှင့် PBS ကို တိုက်ရိုက်စုပ်သည်။အဆင့် 2 ကို ဆက်သွားပါ။ (မိုးရွာရန် ခက်ခဲပြီး ဆဲလ်များ ထပ်မံ ရပ်ဆိုင်းသွားပါက၊ supernatant ကို စွန့်ပစ်ပြီးနောက် 10 မိနစ်အတွင်း 1000×g centrifuged ပြုလုပ်နိုင်သည်၊ ဆဲလ် pellet သည် အဆင့် 2 သို့ ဆက်သွားသည်)

2.Cell lysis- အောက်ဖော်ပြပါဇယား 1-2 ပြင်ဆင်ထားသော lysis စနစ်အရ၊ ၎င်း၏အပူချိန်၊ အခန်းအပူချိန်၊ DNA Eraser နှင့် Foregene Protease Plus II၊ Buffer CL ကို ဖယ်ရှားပါ၊ (Lysis ဖြေရှင်းချက်သည် အသုံးပြုရန် အသင့်ဖြစ်ပါပြီ)။

ဇယား ၁-၂- ကွဲထွက်မှု စနစ်ပြင်ဆင်မှု (မှတ်ချက်- ရေခဲပြင်ပြင်ဆင်မှုတွင်)

3.( နမူနာအဖြစ် 24 – well plate ) Pipette 200 μl of cell lysis master ရောနှောပြီး ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် 5-10 ကြိမ် ထပ်ခါထပ်ခါမှုတ်ပြီး အခန်းအပူချိန် (20-25 ℃) တွင် 5 မိနစ်ကြာ မွှေပေးပါ။

မှတ်ချက်:ပူဖောင်းများဖြစ်ပေါ်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် ပိုက်ပိုက်စကေးကို 200μl သို့မဟုတ် ထိုထက်နည်းအောင် ချိန်ညှိသောအခါ ကျေးဇူးပြု၍ ကျေးဇူးပြု၍ပုံမှန်အားဖြင့် lysis ပြီးနောက် ဆဲလ်များသည် တိမ်များပေါ်လာနိုင်သည်။

4.(ဥပမာအဖြစ် 24 – well plate ) ကို အရည် 20 μl Buffer ST (ဇယား 1-3 တွင်ပြသထားသည့် ပမာဏတွင် အမျိုးမျိုးသော lysis စနစ်များ Buffer ST ကိုထည့်သွင်းထားသည်)၊ အခန်းအပူချိန် (20-25 ℃) တွင် ထပ်ကာထပ်ကာပိုက်ထည့်ခြင်း 5-10 ကြိမ်၊ အခန်းအပူချိန် (20-25 ℃) တွင် 2 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။

မှတ်ချက်:ပိုက်ပက်အစွန်အဖျားကို မျက်နှာပြင်အောက်တွင် စွန့်ပစ်ပြီး lysate ထည့်ထားကြောင်း သေချာစေပါသည်။၊ပူဖောင်းများဖွဲ့စည်းခြင်းကိုရှောင်ရှားရန်၊ ပိုက်ပိုက်ပိုက်စကေးကို 200μl သို့မဟုတ် ထိုထက်နည်းအောင် ချိန်ညှိသောအခါ ကျေးဇူးပြု၍

ဇယား ၁-၃:Buffer ST ကိုထည့်ပါ။

5.The lysate ကို နောက်ဆက်တွဲ RT-qPCR စမ်းသပ်မှုများအတွက် အသုံးပြုသည်။နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်မှုများကို အချိန်မီ မဆောင်ရွက်နိုင်ပါက၊ ကျေးဇူးပြု၍ ၎င်းကို ရေခဲပေါ်တွင် ၂ နာရီထက် မပိုဘဲ ထားကာ -20 ℃ သို့မဟုတ် -80 ℃ (သုံးလထက် မပိုစေရ) တွင် သိမ်းဆည်းပါ။

B: RT စနစ်ပြင်ဆင်မှု

1. 5 × Direct RT Mix ကိုထုတ်၍ ရေခဲရေချိုးခန်းတွင် ထားကာ သဘာဝအတိုင်း အရည်ပျော်သွားအောင် မွှေပြီး နောက်ပိုင်းအသုံးပြုရန်အတွက် ညင်သာစွာ ရောမွှေပါ။RNase-Free ddH2O ကို ထုတ်ယူပြီး အရည်ပျော်ပြီး နောက်ပိုင်းအသုံးပြုရန်အတွက် ရေခဲရေချိုးခန်းတွင် ထားရှိပါ။အောက်ပါဇယား 2-1 အရ ရေခဲပေါ်တွင် တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကို ပြင်ဆင်ပါ။

ဇယား 2-1- RT တုံ့ပြန်မှုစနစ် ပြင်ဆင်ခြင်း။

2. စနစ်ဖော်မြူလာပြီးနောက်၊ အောက်ဖော်ပြပါဇယား 2 -2 တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေ RT တုံ့ပြန်မှုတွင် ညင်သာစွာရောစပ်ပြီး အာရုံစူးစိုက်မှုအကျဉ်းချုံးပြုလုပ်ပါ။

ဇယား 2-2- RT တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေ ဆက်တင်

3. တုံ့ပြန်မှုပြီးစီးပြီးနောက်၊ တုံ့ပြန်မှုထုတ်ကုန်ကို qPCR အတွက် ရေခဲပေါ်တွင် တိုက်ရိုက်ချထားပါ၊ ကျေးဇူးပြု၍ ရေရှည်ထိန်းသိမ်းခြင်း -20 ℃ သို့မဟုတ် -80 ℃ ထားပါ။

မှတ်ချက်- မသန့်စင်သော ပုံစံပလိတ်ကို အသုံးပြုခြင်းကြောင့်၊ အဖြူရောင် မိုးရေစက်များသည် ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း ထုတ်ကုန်တွင် ပေါ်လာနိုင်သည်။ဒါက ပုံမှန်ဖြစ်စဉ်တစ်ခုပါ။နောက်ဆက်တွဲစမ်းသပ်မှုများအတွက် ဆူနာတန်ကို ချက်ချင်း အာရုံစူးစိုက်ပါ။

ရရှိလာသော RT တုံ့ပြန်မှုဖြေရှင်းချက်အား နောက်အဆင့် Real Time PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်များသို့ ပေါင်းထည့်ကာ တုံ့ပြန်မှုစနစ်၏ 10-30% မှ ပမာဏများကို ထည့်ရန် အကြံပြုထားသည်။

C: qPCR တုံ့ပြန်မှုစနစ် ပြင်ဆင်ခြင်း။

1. တုံ့ပြန်မှုစနစ်ပြင်ဆင်ရန်အတွက် အောက်ပါဇယား 3-1 အရ အဆင့် cDNA နမူနာပုံစံတွင် ပြင်ဆင်ထားသော B ၏ သင့်လျော်သောပမာဏ။

မှတ်ချက်- cDNA နမူနာပုံစံပမာဏသည် qPCR စနစ်၏ 10-30% ရှိသည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ 20μl qPCR စနစ်တွင် lysis ကြားခံ 2-6 μl ကိုထည့်ပါ၊ သို့သော် 6 μl ထက်မပိုပါ။

2. qPCR တုံ့ပြန်မှုအတွက် ကောင်းမွန်သော qPCR အခြေအနေများ (Annealing temperature, etc.) ကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ခြင်း (ဇယား 3-2 တွင်ဖော်ပြထားသော တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများ)။

မှတ်ချက်- qPCR တုံ့ပြန်မှုများအတွက် ပိုမိုကောင်းမွန်သောရလဒ်များရရှိရန် အကောင်းဆုံးအခြေအနေများကို အသုံးပြုကြည့်ပါ။

ဇယား 3-1- PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ် ပြင်ဆင်ခြင်း။

1*- primer တုံ့ပြန်မှုစွမ်းဆောင်ရည် ညံ့နေချိန်တွင် Primer concentration ကို 50-900 nM အကွာအဝေးတွင် ချိန်ညှိနိုင်သည်။

မှတ်ချက်။50 တွင် qPCR အတွက်μl စနစ်၊ 20 အရ ဓါတ်ဆေးပမာဏကို အချိုးကျ ချိန်ညှိပါ။μl စနစ်။

2*- fluorescence quantitative thermal cycler အရ ROX Reference Dye ၏ သင့်လျော်သော နောက်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှုကို ရွေးချယ်ပါ။အသုံးများသော fluorescence quantitative စက်ဘီးစီးသူများအတွက် အသင့်လျော်ဆုံး ROX ရည်ညွှန်းဆေး၏ ပြင်းအားကို အောက်ပါဇယားတွင် ပြထားသည်-

ဇယား 3-2- qPCR တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကို ပေးထားသည်။

မှတ်ချက်- အကောင်းဆုံး qPCR အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ရရှိရန်အတွက် မတူညီသောပုံစံများနှင့် မတူညီသော primers များအတွက် တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ရန် gradient PCR ကို အသုံးပြုနိုင်သည်။PCR တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများသည် fluorescence ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသူ၊ ပုံစံခွက်၊ primer စသည်တို့အပေါ် မူတည်၍ ကွဲပြားသည်။ သီးခြားလုပ်ဆောင်မှုတွင်၊ အကောင်းဆုံးတုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများသည် fluorescence quantitative thermal cycler၊ template အမျိုးအစား၊ စိတ်ဝင်စားသည့်အပိုင်းအစ၏အရွယ်အစား၊ ချဲ့ထွင်ထားသောအပိုင်း၏အခြေခံ sequence နှင့် GC ပါဝင်မှုနှင့် primer များ၏ အပူချိန်၊ timene အပါအဝင် တုံ့ပြန်မှုကြာချိန် စသည်တို့ဖြစ်သည်။

Real Time PCR primer ဒီဇိုင်းအခြေခံမူ

ရှေ့သို့ Primer နှင့် Reverse Primer

Real Time PCR အတွက်၊ primer ဒီဇိုင်းသည် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။Primers များသည် PCR amplification ၏ တိကျမှုနှင့် ထိရောက်မှုတို့နှင့် ဆက်စပ်နေပြီး အောက်ပါအခြေခံမူများကို ကိုးကား၍ ဒီဇိုင်းထုတ်နိုင်သည်။

◆ Primer အရှည်- 18-30bp။

◆ GC ပါဝင်မှု- 40-60%။

◆ Tm တန်ဖိုး- Primer 5 ကဲ့သို့သော Primer ဒီဇိုင်းဆော့ဖ်ဝဲသည် primer ၏ Tm တန်ဖိုးကို ပေးနိုင်သည်။အထက်ပိုင်းနှင့် အောက်ပိုင်း primers များ၏ Tm တန်ဖိုးများသည် တတ်နိုင်သမျှ နီးစပ်သင့်သည်။Tm တွက်ချက်မှုဖော်မြူလာကိုလည်း သုံးနိုင်သည်- Tm = 4°C (G + C) + 2°C (A + T)။PCR ကိုလုပ်ဆောင်သောအခါ၊ primer Tm တန်ဖိုး 5°C အောက်ရှိ အပူချိန်ကို annealing temperature အဖြစ် ယေဘူယျအားဖြင့် ရွေးချယ်သည် (သက်ဆိုင်ရာ အပူချိန်တိုးလာခြင်းသည် PCR တုံ့ပြန်မှု၏ တိကျမှုကို တိုးလာစေသည်)။

◆ Primers နှင့် PCR ထုတ်ကုန်များ-

◆ ဒီဇိုင်း primer PCR ချဲ့ထွင်မှု ထုတ်ကုန်အရှည်သည် 100-150bp ပိုကောင်းသည်။

◆ ပုံစံပလိတ်၏ ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ဧရိယာရှိ ဒီဇိုင်းအဖုံးများကို တတ်နိုင်သမျှ ရှောင်ရှားသင့်သည်။

◆ အထက်ပိုင်းနှင့် မြစ်အောက်ပိုင်းရှိ primers များ၏ 3′ အစွန်းများကြားတွင် ဖြည့်စွက်အခြေ 2 သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပို၍ဖွဲ့စည်းခြင်းကို ရှောင်ကြဉ်ပါ။

◆ Primer 3′ terminal base သည် နောက်ထပ် 3 ကြိမ်ဆက်တိုက် G သို့မဟုတ် C ဖြင့် မတည်ရှိနိုင်ပါ။

◆ primers များကိုယ်တိုင် ဖြည့်စွက်ဖွဲ့စည်းပုံများ မပါဝင်နိုင်ပါ၊ သို့မဟုတ်ပါက ဆံညှပ်ဖွဲ့စည်းပုံသည် PCR ချဲ့ထွင်မှုကို ထိခိုက်စေပါသည်။

◆ ATCG အား primer sequence တွင် တတ်နိုင်သမျှ အညီအမျှ ဖြန့်ဝေသင့်ပြီး 3′ terminal base ကို T အဖြစ် ရှောင်ရှားသင့်သည်။

နောက်ဆက်တွဲ1:Cတိုက်ရိုက်RT-qPCR Kit component ဖြည့်စွက်စာ

1.Cell Lysis ဖြေရှင်းချက်