1. ကနဦးနားလည်မှု
ဤအဆင့်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏သက်ကြီးရွယ်အိုများရှေ့တွင် အမှားများမလုပ်မိစေရန်အတွက် အချို့သော အယူအဆများနှင့် ဝေါဟာရများကို နားလည်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
မေး- RT-PCR၊ qPCR၊ Real-time PCR နှင့် real-time RT-PCR အကြား ကွာခြားချက်ကား အဘယ်နည်း။
အဖြေ- RT-PCR သည် ပြောင်းပြန် transcription PCR ဖြစ်သည်။(ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြခြင်း PCR၊ RT-PCR) သည် တွင်ကျယ်စွာအသုံးပြုသော polymerase ကွင်းဆက်တုံ့ပြန်မှု (PCR) ၏ မူကွဲတစ်ခုဖြစ်သည်။RT-PCR တွင်၊ RNA ကြိုးမျှင်ကို နောက်ပြန်လှည့်ကာ ဖြည့်စွက် DNA အဖြစ်သို့ ကူးယူသည်၊ ထို့နောက် PCR မှ DNA ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် ပုံစံပလိတ်အဖြစ် အသုံးပြုသည်။
အချိန်နှင့်တပြေးညီ-PCR နှင့် qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) သည် အတူတူပင်ဖြစ်သည်၊ နှစ်ခုလုံးသည် အချိန်နှင့်တပြေးညီ ပမာဏ PCR ဖြစ်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ PCR ၏ စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် အချိန်နှင့်တပြေးညီ ဒေတာမှတ်တမ်းများ ပါရှိသောကြောင့် စတင်သည့် ပုံစံနံပါတ်များကို တိကျသောခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ချိန်ညှိနိုင်သည်။
Real-time PCR ( real-time fluorescent quantitative PCR) နှင့် Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) နှစ်မျိုးလုံးကို RT-PCR ဟု အတိုကောက်ဟု ထင်ရသော်လည်း နိုင်ငံတကာ ကွန်ဗင်းရှင်းမှာ- RT-PCR သည် အထူးအားဖြင့် ပြောင်းပြန် စာသားပြောင်းခြင်းကို ရည်ညွှန်းပါသည်။PCR၊ Real-time PCR ကို ယေဘုယျအားဖြင့် အတိုကောက် qPCR (quantitative real-time PCR).
နှင့် အချိန်နှင့်တပြေးညီ RT-PCR (RT-qPCR)၊ ၎င်းသည် fluorescent quantitative နည်းပညာဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ပြောင်းပြန် transcription PCR ဖြစ်သည်။: ပထမဆုံး RNA ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းမှ cDNA (RT) ကို ရယူပြီးနောက် အရေအတွက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (qPCR) အတွက် Real-time PCR ကို အသုံးပြုပါ။ဓာတ်ခွဲခန်းအများစုသည် RT-qPCR၊ ဆိုလိုသည်မှာ RNA ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုနှိမ့်ချထိန်းချုပ်မှုဆိုင်ရာ သုတေသနကို ပြုလုပ်သည်၊ ထို့ကြောင့် ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် လူတိုင်းပြောနေကြသည့် qPCR သည် RT-qPCR ကို အမှန်တကယ်ရည်ညွှန်းသည်၊ သို့သော် လက်တွေ့အသုံးချမှုများတွင် DNA စစ်ဆေးမှုများများစွာရှိနေသေးသည်ကို မမေ့ပါနှင့်။အသည်းရောင်အသားဝါ B ဗိုင်းရပ်စ် HBV ထောက်လှမ်းခြင်းကဲ့သို့သော အရေအတွက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
မေးခွန်း- fluorescent quantitative PCR အများအပြားကိုဖတ်ပြီးနောက်၊ ချဲ့ထားသောအပိုင်းအစကို 80-300bp အကွာအဝေးအတွင်း အဘယ်ကြောင့်ထိန်းချုပ်သင့်သနည်း။
ဖြေ: gene sequence တစ်ခုစီ၏ အရှည်သည် ကွဲပြားသည်၊ အချို့မှာ kb များစွာ၊ အချို့သည် bp ရာပေါင်းများစွာ ရှိကြသည်၊ သို့သော် primers များကို ဒီဇိုင်းထုတ်သောအခါတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် ထုတ်ကုန်၏အရှည် 80-300bp ဖြစ်ရန် လိုအပ်သည်၊ တိုလွန်းသည် သို့မဟုတ် ရှည်လွန်းသည် fluorescent quantitative PCR detection အတွက် မသင့်တော်ပါ။ထုတ်ကုန်အပိုင်းအစသည် primer-dimer နှင့်ခွဲခြားရန်တိုလွန်းသည်။primer-dimer ၏အရှည်သည် 30-40bp ခန့်ရှိပြီး 80bp ထက်နည်းပါက primer-dimer သို့မဟုတ် product လား ခွဲခြားရန်ခက်ခဲသည်။ထုတ်ကုန်အပိုင်းအစသည် 300bp ထက် ရှည်လွန်းပါက၊ ၎င်းသည် ချဲ့ထွင်မှုနည်းသော ထိရောက်မှုကို အလွယ်တကူ ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပြီး ဗီဇပမာဏကို ထိထိရောက်ရောက် မရှာဖွေနိုင်ပါ။
ဥပမာအားဖြင့်၊ စာသင်ခန်းတစ်ခုတွင် လူမည်မျှရှိသည်ကို ရေတွက်သည့်အခါတွင် ပါးစပ်မည်မျှရှိသည်ကိုသာ ရေတွက်ရန်လိုသည်။မျိုးရိုးဗီဇကို စစ်ဆေးသောအခါတွင်လည်း အလားတူပင်၊ တစ်မျိုးသားလုံးအတွက် ကိုယ်စားပြုရန်အတွက် မျိုးရိုးဗီဇတစ်ခု၏ အစီအစဥ်တစ်ခုကိုသာ ရှာဖွေရန် လိုအပ်ပါသည်။လူတွေကို ရေတွက်ချင်ရင် ပါးစပ်၊ နှာခေါင်း၊ နား၊ မျက်မှန် နှစ်ခုစလုံးကို ရေတွက်ဖို့ လိုပြီး အမှားလုပ်ရတာ လွယ်ကူပါတယ်။
ချဲ့ထွင်ရန်၊ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ သုတေသနတွင်၊ မျိုးစိတ်တစ်ခုမှတစ်ခုသို့ သုတေသနပြုမှုများစွာရှိပါသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် မျိုးစိတ်များ၏ မျိုးရိုးဗီဇသည် အလွန်ရှည်လျားသောကြောင့်၊ ဘက်တီးရီးယား 16S sequencing ကဲ့သို့သော အပိုင်းအစများအားလုံးကို တိုင်းတာရန်မှာ မလိုအပ်ဘဲ၊ ဘက်တီးရီးယားများ၏ ကွန်ဆာဗေးတစ်အစီအစဥ်ကို တိုင်းတာရန်အတွက် ဘက်တီးရီးယားများ၏ အရေအတွက်ကို တိုင်းတာရန် မလိုအပ်ပေ။
Q- qPCR primer ဒီဇိုင်းအတွက် အကောင်းဆုံးအရှည်က ဘယ်လောက်လဲ။
ဖြေ- ယေဘုယျအားဖြင့်ပြောရလျှင် primer အရှည်သည် 20-24bp ခန့်ရှိပြီး ပိုကောင်းသည်။သေချာတာကတော့၊ primer ကို ဒီဇိုင်းဆွဲတဲ့အခါ primer ရဲ့ TM တန်ဖိုးကို အာရုံစိုက်ရမှာပါ၊ ဘာကြောင့်လဲဆိုတော့ ဒါက အကောင်းဆုံး annealing အပူချိန်နဲ့ ဆက်စပ်နေလို့ပါ။စမ်းသပ်မှုများစွာပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ 60°C သည် TM တန်ဖိုးပိုကောင်းကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။annealing temperature သည် အလွန်နိမ့်ပါက၊ အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို အလွယ်တကူ ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။annealing အပူချိန် မြင့်မားနေပါက၊ ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှု နည်းပါးမည်ဖြစ်ပြီး၊ amplification curve ၏ အထွတ်အထိပ်သည် နောက်ပိုင်းတွင် စတင်မည်ဖြစ်ပြီး CT တန်ဖိုး နှောင့်နှေးမည်ဖြစ်သည်။
မေး- ဆိုးဆေးနည်းလမ်းသည် စူးစမ်းလေ့လာသည့်နည်းလမ်းနှင့် မည်သို့ကွာခြားသနည်း။
အဖြေ: ဆိုးဆေးနည်းSYBR Green Ⅰ၊ PicoGreen၊ BEBO ကဲ့သို့သော ချောင်းဆိုးဆေးအချို့သည် ၎င်းတို့ကိုယ်တိုင် အလင်းရောင်မထုတ်လွှတ်သော်လည်း ကြိုးနှစ်ထပ်သော DNA ၏သေးငယ်သောအချောင်းနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် အလင်းရောင်ထုတ်လွှတ်မည်ဖြစ်သည်။ထို့ကြောင့် PCR တုံ့ပြန်မှုအစတွင်၊ စက်သည် fluorescent အချက်ပြမှုကို မတွေ့ရှိနိုင်ပါ။တုံ့ပြန်မှုသည် annealing-extension အဆင့်သို့ရောက်သောအခါ၊ ကြိုးနှစ်ထပ်ကိုဖွင့်ပြီး DNA polymerase ၏လုပ်ဆောင်ချက်အောက်တွင် ကြိုးအသစ်တစ်ခုကို ပေါင်းစပ်ပြီး fluorescent မော်လီကျူးသည် dsDNA minor groove နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။PCR လည်ပတ်မှု အရေအတွက် တိုးလာသည်နှင့်အမျှ၊ ဆိုးဆေးများကို ကြိုးနှစ်ထပ် DNA နှင့် ပေါင်းစပ်ကာ ချောင်းလှိုင်းအချက်ပြမှုကိုလည်း စဉ်ဆက်မပြတ် မြှင့်တင်ထားသည်။ဆိုးဆေးနည်းကို သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနတွင် အဓိကအသုံးပြုသည်။
PS- စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်ရာတွင် သတိထားပါ၊ ဆိုးဆေးသည် လူ့ DNA နှင့် ပေါင်းစပ်ရမည်ဖြစ်ပြီး ၎င်းကို ချောင်းအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲရန် သတိပြုပါ။
ဆိုးဆေးနည်း (ဘယ်)၊ စူးစမ်းနည်း (ညာ)၊
PS- စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်ရာတွင် သတိထားပါ၊ ဆိုးဆေးသည် လူ့ DNA နှင့် ပေါင်းစပ်ရမည်ဖြစ်ပြီး ၎င်းကို ချောင်းအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲရန် သတိပြုပါ။
SYBR Green Ⅰ သည် DNA ၏ သေးငယ်သော groove နှင့် ချိတ်ဆက်သည်။
စူးစမ်းနည်းTaqman probe သည် အသုံးအများဆုံး hydrolysis probe ဖြစ်သည်။စုံစမ်းစစ်ဆေးမှု၏ 5′ ၏အဆုံးတွင် fluorescent အုပ်စုတစ်ခုရှိပြီး အများအားဖြင့် FAM နှင့် probe ကိုယ်တိုင်သည် ပစ်မှတ် gene နှင့် လိုက်ဖက်သော sequence တစ်ခုဖြစ်သည်။3′ အဆုံးတွင် ချောင်းမီးသတ်အုပ်စု ရှိသည်။fluorescence resonance စွမ်းအင်လွှဲပြောင်းခြင်းဆိုင်ရာနိယာမအရ (Förster resonance energy transfer, FRET)၊ သတင်းထောက် fluorescent group (donor fluorescent molecule) နှင့် quenching fluorescent group (acceptor fluorescent molecule) တို့သည် spectra overlap နှင့် အကွာအဝေးအလွန်နီးကပ်နေသောအခါ (7-10nm) သည် donor fluorescent molecule ၏ exacute oreculation ကိုဖြစ်စေနိုင်သည်၊ autofluorescence အားနည်းနေချိန်တွင်၊ထို့ကြောင့်၊ PCR တုံ့ပြန်မှုအစတွင်၊ စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုစနစ်တွင် အခမဲ့ဖြစ်ပြီး နဂိုအတိုင်းရှိသည့်အခါ သတင်းထောက် fluorescent အုပ်စုသည် fluorescence ကို ထုတ်လွှတ်မည်မဟုတ်ပါ။လိမ်းသောအခါတွင် primer နှင့် probe ကို template နှင့် ချိတ်ပါ။တိုးချဲ့မှုအဆင့်တွင်၊ ပိုလီမာရတ်သည် ကွင်းဆက်အသစ်များကို စဉ်ဆက်မပြတ် ပေါင်းစပ်သည်။DNA polymerase တွင် 5′-3′ exonuclease လုပ်ဆောင်ချက် ပါရှိသည်။probe သို့ရောက်ရှိသောအခါ၊ DNA polymerase သည် template မှ probe ကို hydrolyze လုပ်မည်ဖြစ်ပြီး၊ reporter fluorescent group ကို quencher fluorescent group မှ ခွဲထုတ်ပြီး fluorescent signal ကို ထုတ်လွှတ်မည်ဖြစ်ပါသည်။probe နှင့် template အကြား တစ်ခုမှတစ်ခု ဆက်စပ်မှုရှိသောကြောင့်၊ probe method သည် စစ်ဆေးမှု၏ တိကျမှုနှင့် sensitivity အရ ဆိုးဆေးနည်းလမ်းထက် သာလွန်ပါသည်။စစ်ဆေးခြင်းနည်းလမ်းကို ရောဂါရှာဖွေရာတွင် အဓိကအသုံးပြုသည်။
Q: absolute quantification ဆိုတာဘာလဲ။Relative Quantification ဆိုတာ ဘာလဲ။
ဖြေ: absolute quantification ဆိုသည်မှာ သွေး 1ml တွင် HBV ဗိုင်းရပ်စ် မည်မျှရှိသည်ကဲ့သို့သော qPCR မှ စမ်းသပ်မည့် နမူနာ၏ ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်ကို တွက်ချက်ခြင်းကို ရည်ညွှန်းသည်။နှိုင်းယှဥ်အရေအတွက် တိုင်းတာခြင်းမှရရှိသောရလဒ်မှာ တိကျသောနမူနာတစ်ခုရှိ ပစ်မှတ်ဗီဇပမာဏပြောင်းလဲမှုဖြစ်ပြီး အခြားရည်ညွှန်းနမူနာနှင့် ပတ်သက်သည့် ဗီဇဖော်ပြချက်အား ထိန်းညှိခြင်း သို့မဟုတ် လျှော့ချခြင်းဖြစ်ပါသည်။
မေး- RNA ထုတ်ယူမှုပမာဏ၊ ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြမှု စွမ်းဆောင်ရည်နှင့် ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည်တို့သည် စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိပါသလား။
မေး- နမူနာသိုလှောင်မှု၊ ထုတ်ယူသည့်ဓာတ်များ၊ ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြသည့် ဓာတ်ပစ္စည်းများနှင့် အလင်းပို့လွှတ်နိုင်သော စားသုံးပစ္စည်းများသည် စမ်းသပ်မှုရလဒ်များအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိပါသလား။
မေး- စမ်းသပ်ဒေတာကို ဘယ်နည်းလမ်းက ပြင်ပေးနိုင်မလဲ။
ဤပြဿနာများနှင့်ပတ်သက်၍ ကျွန်ုပ်တို့သည် ၎င်းတို့အား အောက်ပါအဆင့်မြင့်နှင့် အဆင့်မြင့်ကဏ္ဍများတွင် အသေးစိတ်ဖော်ပြပါမည်။
2. အဆင့်မြင့်အသိပညာ
အချိန်နှင့်တပြေးညီ fluorescent quantitative PCR နှင့် ပတ်သက်၍၊ သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနစာတမ်းပေါင်း ထောင်ပေါင်းများစွာကို နှစ်စဉ် ထုတ်ဝေနေသည်ဟူသော အဖြစ်မှန်ကို အသိအမှတ်ပြုရမည်ဖြစ်ပြီး fluorescent quantitative PCR နည်းပညာသည် အရေအတွက် အနည်းငယ်မဟုတ်ပေ။
fluorescent quantitative PCR စမ်းသပ်မှုကို တိုင်းတာရန် ဘုံစံမရှိပါက၊ ရလဒ်များသည် ကျယ်ပြန့်စွာ ကွဲပြားနိုင်သည်။တူညီသောမျိုးစိတ်များ၏ တူညီသောဗီဇအတွက်၊ တူညီသောလုပ်ဆောင်မှုနည်းလမ်းဖြင့်၊ ထောက်လှမ်းခြင်းရလဒ်များသည် ကျယ်ပြန့်စွာကွဲပြားမည်ဖြစ်ပြီး နောက်ကျလာသူများအတွက် တူညီသောရလဒ်များကို ထပ်တလဲလဲပြုလုပ်ရန် ခက်ခဲမည်ဖြစ်သည်။ဘယ်ဟာမှန်တယ် ဘယ်ဟာမှားတယ်ဆိုတာ ဘယ်သူမှမသိပါဘူး။
၎င်းသည် fluorescent quantitative PCR သည် လိမ်လည်မှုနည်းပညာ သို့မဟုတ် ယုံကြည်စိတ်ချရသောနည်းပညာဖြစ်သည်ဟု ဆိုလိုပါသလား။မဟုတ်ဘူး၊ fluorescent quantitative PCR က ပိုထိခိုက်လွယ်ပြီး ပိုတိကျတာကြောင့်ဖြစ်ပြီး၊ မှားယွင်းတဲ့လုပ်ဆောင်ချက်အနည်းငယ်က လုံးဝဆန့်ကျင်ဘက်ရလဒ်တွေကို ထုတ်ပေးနိုင်လို့ပါ။ဆုံးရှုံးမှုလေးတစ်ခုက မိုင်ထောင်ချီဝေးတယ်။.ဆောင်းပါးရေးသားသူသည် ဝေဖန်သုံးသပ်သူများ အကြိမ်ကြိမ် နှိပ်စက်ခံရနိုင်သည်။တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ ဂျာနယ်၏ဝေဖန်သုံးသပ်သူများသည် မတူညီသောစမ်းသပ်မှုရလဒ်များမှ ရွေးချယ်ရန်ခက်ခဲသည်။
အလုံးစုံအားဖြင့်၊ အချိန်နှင့်တစ်ပြေးညီ PCR စမ်းသပ်မှုများတွင် သဘောတူညီမှုမရှိခြင်းကို ညွှန်ပြသည်။ဤအဆုံးသတ်ရန်အတွက် လုပ်ငန်းနယ်ပယ်ရှိ အကြီးတန်းသိပ္ပံပညာရှင်များသည် စံချိန်စံညွှန်းများ စတင်ရေးဆွဲရန်၊ဤစံနှုန်းများနှင့် ကိုက်ညီရန် ဆောင်းပါးတွင် လိုအပ်သော အချက်အလက်အချို့ (လိုအပ်သော ဒေတာ အပါအဝင်) အချို့သော လိုအပ်သော စမ်းသပ်မှုများနှင့် ဒေတာလုပ်ဆောင်ခြင်းဆိုင်ရာ အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို ပံ့ပိုးကူညီသူများပေးရန် လိုအပ်ပါသည်။
သုံးသပ်သူများသည် ဤအသေးစိတ်အချက်အလက်များကိုဖတ်ရှုခြင်းဖြင့် စမ်းသပ်မှု၏အရည်အသွေးကို အကဲဖြတ်နိုင်ပါသည်။အနာဂတ်စာဖတ်သူများသည် ၎င်းကို စမ်းသပ်မှုကို ထပ်ခါတလဲလဲ သို့မဟုတ် စမ်းသပ်မှုကို မြှင့်တင်ရန် ၎င်းကိုလည်း အသုံးပြုနိုင်သည်။ထို့နောက် ဤနည်းဖြင့်ရရှိသော စမ်းသပ်မှုရလဒ်များသည် အချက်အလက်များ ပြည့်စုံပြီး အရည်အသွေးမြင့်မားပြီး အသုံးပြုနိုင်မည်ဖြစ်သည်။
MIBBI (ဇီဝဗေဒနှင့် ဇီဝဆေးဘက်ဆိုင်ရာ စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုများအတွက် အနိမ့်ဆုံးအချက်အလက်များ -http://www.mibbi.org) ပေါ်ပေါက်လာသည်။MIBBI သည် စမ်းသပ်မှုများအတွက် စံနှုန်းများကို ပံ့ပိုးပေးသော ပရောဂျက်တစ်ခုဖြစ်သည်။.သဘာဝအတိုင်း ထုတ်ဝေသည်။ဤပရောဂျက်သည် ဆဲလ်ဇီဝဗေဒ၊ Microarray၊ qPCR စသည်တို့အပါအဝင် အမျိုးမျိုးသောဇီဝစမ်းသပ်မှုများကို ရည်ရွယ်ပြီး လက်ရေးစာမူများပေးပို့သည့်အခါ စမ်းသပ်မှုအမျိုးအစားတစ်ခုစီအတွက် ပံ့ပိုးပေးပါသည်။အဲဒီအချက်အလက်ကို အချိန်တိုင်း ပေးသင့်တယ်။
MIBBI ပရောဂျက်တွင် fluorescent quantitative PCR နှင့် ပတ်သက်သော ဆောင်းပါးနှစ်ပုဒ် ရှိပါသည်။:
· RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - အချိန်နှင့်တပြေးညီ အရေအတွက် PCR ဒေတာအတွက် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ထားသော ဘာသာစကားနှင့် အစီရင်ခံခြင်းလမ်းညွှန်။
· MIQE (Quantitative Real-Time PCR စမ်းသပ်မှုများကို ထုတ်ဝေရန်အတွက် အနိမ့်ဆုံးအချက်အလက်များ) - အချိန်နှင့်တပြေးညီ အရေအတွက် PCR စမ်းသပ်မှုများအကြောင်း ဆောင်းပါးများကို ထုတ်ဝေရန်အတွက် အနည်းဆုံးအချက်အလက်များ။
ပထမဦးစွာ၊ RDML၊ ဝေါဟာရသတ်မှတ်ချက်အကြောင်းပြောကြပါစို့။
အရာအားလုံးအတွက် စံသတ်မှတ်ချက်မရှိပါက၊ ဆွေးနွေးမှုကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ရန် မဖြစ်နိုင်သောကြောင့် စာမေးပွဲတွင် ဝေါဟာရများ၏ ရှင်းလင်းချက်သည် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။
fluorescent quantitative PCR စမ်းသပ်မှုတွင် အသုံးပြုသည့် အသုံးအနှုန်းများတွင် အောက်ပါ အကြောင်းအရာများ ပါဝင်သည်။QIAGEN သည် ကျွန်ုပ်တို့အတွက် အကောင်းဆုံး အနှစ်ချုပ်ကို ပြုလုပ်ထားသည်။အောက်ဖော်ပြပါအားလုံးသည် ခြောက်သည်။ကုန်စည် .
အသံချဲ့စက်မျဉ်းကွေး
ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးသည် PCR လုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း ပြုလုပ်ထားသည့် မျဉ်းကွေးကို ရည်ညွှန်းသည်၊ abscissa အဖြစ် သံသရာနံပါတ်နှင့် ordinate အဖြစ် တုံ့ပြန်မှုအတွင်း real-time fluorescence intensity ကို ရည်ညွှန်းသည်။
အလွန်ကောင်းမွန်သော အသံချဲ့စက်မျဉ်းကွေးတစ်ခုတွင် အောက်ပါလက္ခဏာများ ရှိသင့်သည်။: အခြေခံမျဉ်းသည် ပြန့်ပြူးနေသည် သို့မဟုတ် အနည်းငယ် လျော့ကျသွားပြီး သိသိသာသာ အထက်သို့ လမ်းကြောင်း မရှိပါ။မျဉ်းကွေး၏ inflection point သည် ရှင်းလင်းပြီး exponential phase ၏ slope သည် amplification efficiency နှင့် အချိုးကျပါသည်။slope ကြီးလေ၊ amplification efficiency ပိုမြင့်လေ၊အလုံးစုံချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး မျဉ်းပြိုင်စနစ်သည် ကောင်းမွန်ပြီး tube တစ်ခုစီ၏ ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် ဆင်တူကြောင်း ညွှန်ပြသည်။low-concentration samples များ၏ amplification curve ၏ exponential အဆင့်သည် ထင်ရှားပါသည်။
အခြေခံလိုင်း (Baseline)
အခြေခံအဆင့်သည် အစောပိုင်းစက်ဝန်း၏ ဆူညံသံအဆင့်ဖြစ်သည်။ချဲ့ထွင်မှုထုတ်ကုန်ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော မီးချောင်းတန်ဖိုး တိုးလာခြင်းကြောင့် ဤကာလအတွင်း 3rd နှင့် 15th စက်ဝိုင်းကြားတွင် တိုင်းတာလေ့ရှိပါသည်။အခြေခံမျဉ်းကို တွက်ချက်ရန် အသုံးပြုသည့် သံသရာ အရေအတွက် ကွဲပြားနိုင်ပြီး မြင့်မားသော ပုံစံခွက်ပမာဏကို အသုံးပြုပါက သို့မဟုတ် ပစ်မှတ် ဗီဇ၏ ဖော်ပြမှုအဆင့် မြင့်မားပါက လျှော့ချရန် လိုအပ်နိုင်သည်။
အခြေခံလိုင်းကိုသတ်မှတ်ခြင်းသည် linearity amplification curve မှ fluorescence data ကိုကြည့်ရှုရန်လိုအပ်သည်။ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၏ ကြီးထွားမှုသည် အခြေခံစက်ဝန်းထိပ်နံပါတ်ထက် သံသရာနံပါတ်ထက်ကြီးသော သံသရာနံပါတ်ဖြင့် စတင်နိုင်ရန် အခြေခံလိုင်းကို သတ်မှတ်ထားသည်။ပစ်မှတ်တစ်ခုစီအတွက် အခြေခံအချက်များကို တစ်ဦးချင်းသတ်မှတ်ရန် လိုအပ်သည်။အစောပိုင်းစက်ဝန်းများတွင် တွေ့ရှိသည့် ပျမ်းမျှ fluorescence တန်ဖိုးများကို ချဲ့ထွင်ထားသော ထုတ်ကုန်များတွင် ရရှိသော fluorescence တန်ဖိုးများမှ နုတ်ထွက်ရန် လိုအပ်ပါသည်။အမျိုးမျိုးသော Real-Time PCR ဆော့ဖ်ဝဲလ်၏ နောက်ဆုံးဗားရှင်းများသည် နမူနာတစ်ခုချင်းစီအတွက် အခြေခံလိုင်းဆက်တင်များကို အလိုအလျောက် ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်နိုင်စေပါသည်။
PCR amplification တုံ့ပြန်မှု၏ ပထမအကြိမ်အနည်းငယ်အတွင်း၊ fluorescence signal သည် များစွာမပြောင်းလဲပါ။မျဉ်းဖြောင့်ကို ချဉ်းကပ်ခြင်းအား အခြေခံမျဉ်းဟု ခေါ်သည်၊ သို့သော် ပထမ စက်ဝိုင်းအနည်းငယ်ကို အနီးကပ်ကြည့်လျှင် အောက်ဖော်ပြပါပုံတွင် ဖြစ်ပျက်နေသည့် အခြေခံမျဉ်းကြောင်းကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရပါသည်။
နောက်ခံ Background ကို ရည်ညွှန်းသည်။
တုံ့ပြန်မှုတွင် အတိအကျမဟုတ်သော fluorescence တန်ဖိုး။ဥပမာ- ထိရောက်မှုမရှိသော မီးချောင်းမီးငြိမ်းခြင်း၊သို့မဟုတ် SYBR Green ကိုအသုံးပြုခြင်းကြောင့် နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA ပုံစံများ အများအပြား။signal ၏နောက်ခံအစိတ်အပိုင်းများကို Real-Time PCR software algorithm ဖြင့် သင်္ချာနည်းဖြင့် ဖယ်ရှားပါသည်။
သတင်းထောက်အချက်
Reporter signal သည် Real-Time PCR အတွင်း SYBR Green သို့မဟုတ် အညွှန်းတပ်ထားသော မျဥ်းသီး-သီးသန့်စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုများမှ ထုတ်ပေးသော ချောင်းအချက်ပြမှုကို ရည်ညွှန်းသည်။
ပုံမှန်သတင်းထောက်အချက်ပြမှု (RN)
RN သည် စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင်တိုင်းတာသည့် passive ရည်ညွှန်းဆေး၏ fluorescence ပြင်းထန်မှုဖြင့် ပိုင်းခြားထားသော သတင်းထောက်ဆိုးဆေး၏ အလင်းရောင်ပြင်းအားကို ရည်ညွှန်းသည်။
Passive Reference ဆိုးဆေး
အချို့သော Real-Time PCR များတွင်၊ချောင်းဆိုးဆေး ROX ကို အတွင်းပိုင်းအကိုးအကားအဖြစ် ချောင်း၏အချက်ပြမှုကို ပုံမှန်ဖြစ်စေရန် အသုံးပြုသည်။.မမှန်ကန်သောပိုက်လိုင်းများ၊ ကောင်းမွန်သောအနေအထားနှင့် မီးချောင်းများ အတက်အကျများကို ကောင်းစွာအလိုက်တသိကြောင့် ကွဲလွဲမှုများကို ပြုပြင်ပေးသည်။
အလင်းတန်းအဆင့် (threshold)
နောက်ခံတန်ဖိုးအထက်နှင့် ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေး၏ ကုန်းပြင်မြင့်တန်ဖိုးအောက်တွင် သိသိသာသာ ချိန်ညှိထားသည်။PCR သိရှိခြင်း၏ log-linear အကွာအဝေးကိုကိုယ်စားပြုသော amplification မျဉ်းကွေး၏မျဉ်းကြောင်းဧရိယာတွင်တည်ရှိရမည်။PCR ၏ log-linear အဆင့်ကို အလွယ်တကူ ခွဲခြားသိမြင်နိုင်စေရန် log-amplification curve view တွင် ကန့်သတ်ချက်များကို သတ်မှတ်သင့်သည်။အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR တွင် ပစ်မှတ်များစွာသော ဗီဇများရှိပါက၊ ပစ်မှတ်တစ်ခုစီအတွက် သတ်မှတ်ချက်ကို သတ်မှတ်ရပါမည်။ယေဘုယျအားဖြင့် PCR တုံ့ပြန်မှု 15 ပတ်၏ fluorescence signal ကို fluorescence နောက်ခံအချက်ပြမှုအဖြစ် အသုံးပြုပြီး fluorescence threshold သည် PCR ၏ ပထမ 3 မှ 15 cycles ၏ fluorescence signal ၏ စံသွေဖည်မှု 10 ဆဖြစ်ပြီး၊ fluorescence threshold ကို PCR အဆင့်တွင် တိုးချဲ့သတ်မှတ်ထားသည်။ယေဘူယျအားဖြင့်၊ ကိရိယာတစ်ခုစီတွင် အသုံးမပြုမီ ၎င်း၏ fluorescence အဆင့်သတ်မှတ်ထားသည်။
Cycle Threshold (CT) သို့မဟုတ် Crossing Point (CP)
ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးသည် တံခါးခုံကို ဖြတ်သွားသည့် စက်ဝန်း (ဆိုလိုသည်မှာ၊ အလင်းဖြာထွက်မှု သိသိသာသာ တိုးလာနေသည့် အမှတ်)။CT သည် အပိုင်းအစတစ်ခု ဖြစ်နိုင်ပြီး စတင်သည့်ပုံစံ၏ ပမာဏကို တွက်ချက်နိုင်သည်။CT တန်ဖိုးသည် PCR တုံ့ပြန်မှုပြွန်တစ်ခုစီရှိ fluorescent အချက်ပြမှု သတ်မှတ်အဆင့်သို့ရောက်ရှိသောအခါ ကြုံတွေ့ခဲ့ရသည့် သံသရာအရေအတွက်ကို ကိုယ်စားပြုသည်။တမ်းပလိတ်တစ်ခုစီ၏ CT တန်ဖိုးနှင့် တမ်းပလိတ်၏ ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်၏ လော့ဂရစ်သမ်ကြားတွင် မျဉ်းသားသော ဆက်နွယ်မှုရှိပြီး၊ကနဦးမိတ္တူနံပါတ် ပိုမြင့်သည်၊ CT တန်ဖိုး သေးငယ်လေ၊ နှင့် အပြန်အလှန်အားဖြင့်.abscissa သည် CT တန်ဖိုးကို ကိုယ်စားပြုပြီး ordinate သည် ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်၏ လော့ဂရစ်သမ်ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ထို့ကြောင့်၊ အမည်မသိနမူနာ၏ CT တန်ဖိုးကို ရရှိသရွေ့၊ နမူနာ၏ ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်ကို စံမျဉ်းကွေးမှ တွက်ချက်နိုင်သည်။
ΔCT တန်ဖိုး
ΔCT တန်ဖိုးကို ဖော်ပြသည်။ပစ်မှတ်ဗီဇနှင့် သက်ဆိုင်ရာ endogenous ရည်ညွှန်းဗီဇ CT တန်ဖိုးကြား ကွာခြားချက်အိမ်ထိန်း ဗီဇကဲ့သို့ ၊ အသုံးပြုထားသော ပုံစံခွက်ပမာဏကို ပုံမှန်ဖြစ်စေရန် အသုံးပြုသည်-
⇒ΔCT = CT (ပစ်မှတ် ဗီဇ) – CT (endogenous ရည်ညွှန်း ဗီဇ)
ΔΔCT တန်ဖိုး
ΔΔCT တန်ဖိုးသည် အကျိုးစီးပွားနမူနာတစ်ခု၏ ပျမ်းမျှ ΔΔCT တန်ဖိုး (ဥပမာ၊ လှုံ့ဆော်ထားသော ဆဲလ်များ) နှင့် ရည်ညွှန်းနမူနာတစ်ခု၏ ΔΔCT တန်ဖိုး (ဥပမာ၊ မလှုံ့ဆော်ထားသော ဆဲလ်များ) အကြား ခြားနားချက်ကို ဖော်ပြသည်။အကိုးအကားနမူနာကို ချိန်ညှိနမူနာဟုလည်း ခေါ်တွင်ပြီး အခြားနမူနာအားလုံးကို နှိုင်းရအရေအတွက် တိုင်းတာရန်အတွက် ၎င်းကို ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်သည်-
⇒ΔΔCT = ပျမ်းမျှ ΔCT (စိတ်ဝင်စားမှုနမူနာ) – ပျမ်းမျှ ΔCT (အကိုးအကား နမူနာ)
Endogenous ရည်ညွှန်းဗီဇများ (endogenous ရည်ညွှန်းသောဗီဇ)
အိမ်ထိန်းဗီဇများ (အိမ်ထိန်းဗီဇများ) ကဲ့သို့သော endogenous ရည်ညွှန်းဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုအဆင့်များသည် နမူနာများကြားတွင် ကွဲပြားမှုမရှိပါ။ရည်ညွှန်းဗီဇ၏ CT တန်ဖိုးများကို ပစ်မှတ်ဗီဇနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းသည် ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ ဖော်ပြမှုအဆင့်ကို ထည့်သွင်းသည့် RNA သို့မဟုတ် cDNA ပမာဏသို့ ပုံမှန်ဖြစ်စေသည် (အထက် ΔCT တန်ဖိုးများကို အပိုင်းကိုကြည့်ပါ)။
Internal reference genes သည် မှန်ကန်သည်။ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော RNA ပြိုကွဲခြင်း သို့မဟုတ် RNA နမူနာများတွင် အင်ဇိုင်းတားဆေးများ ရှိနေခြင်းအပြင် RNA ပါဝင်မှု ကွဲပြားခြင်း၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း ထိရောက်မှု၊ နျူကလိစ်အက်ဆစ် ပြန်လည်ရယူခြင်းနှင့် နမူနာကိုင်တွယ်ခြင်း။အကောင်းဆုံးရည်ညွှန်းဗီဇ(များ)ကို ရွေးရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် စမ်းသပ်ဆဲဆက်တင်ပေါ်တွင် မူတည်၍ အကောင်းဆုံးကိုးကားမှုရွေးချယ်မှုကို ခွင့်ပြုရန် အယ်လဂိုရီသမ်ကို ပြင်ဆင်ထားပါသည်။
အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှု
ပစ်မှတ်အစီအစဥ်ကဲ့သို့ တူညီသောတုံ့ပြန်မှုတွင် ချဲ့ထွင်ထားသော ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုနှင့် ကွဲပြားသော probe (ဆိုလိုသည်မှာ၊ duplex PCR လုပ်ဆောင်နေသည်)။ပစ်မှတ်အစီအစဥ်ကို ရှာမတွေ့သည့်အခါကဲ့သို့ မအောင်မြင်သော ချဲ့ထွင်မှုများကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် အတွင်းပိုင်းထိန်းချုပ်မှုများကို အသုံးပြုသည်။
Calibration နမူနာ
မျိုးရိုးဗီဇ၏ နှိုင်းရဖော်ပြမှုအဆင့်ကို ဆုံးဖြတ်ရန် အခြားနမူနာအားလုံးကို နှိုင်းယှဉ်ရန်အတွက် ရည်ညွှန်းနမူနာတစ်ခု (ဥပမာ၊ ဆဲလ်လိုင်း သို့မဟုတ် တစ်ရှူးမှ သန့်စင်ထားသော RNA) ကို နှိုင်းယှဥ်အရေအတွက် ခွဲခြားသတ်မှတ်ရာတွင် အသုံးပြုသည့် ဗီဇတစ်ခု၏ နှိုင်းရဖော်ပြမှုအဆင့်ကို ဆုံးဖြတ်ရန်။ချိန်ညှိနမူနာသည် မည်သည့်နမူနာ ဖြစ်နိုင်သည်၊ သို့သော် များသောအားဖြင့် ထိန်းချုပ်မှု (ဥပမာ၊ မကုသရသေးသော နမူနာ သို့မဟုတ် စမ်းသပ်မှု၏ သုညမှ နမူနာ)။
အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုများ
ထိန်းချုပ်တုံ့ပြန်မှုများကို အသုံးပြုtemplate ပမာဏကို သိရှိသည်။.primer set သို့မဟုတ် primer-probe set သည် ကောင်းမွန်စွာအလုပ်လုပ်ကြောင်းနှင့် တုံ့ပြန်မှုမှန်ကန်ကြောင်း စစ်ဆေးရန်အတွက် အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုများကို မကြာခဏအသုံးပြုပါသည်။
Template Control (NTC) မရှိပါ
ပုံမှန်အားဖြင့် ရေဖြင့် အစားထိုးသည့် ပုံစံမှလွဲ၍ လိုအပ်သော ချဲ့ထွင်မှု တုံ့ပြန်မှု၏ လိုအပ်သော အစိတ်အပိုင်းများ ပါဝင်သော ထိန်းချုပ်တုံ့ပြန်မှု။NTC ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် ဓာတ်ပစ္စည်းများ ညစ်ညမ်းခြင်း သို့မဟုတ် နိုင်ငံခြား DNA ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ညစ်ညမ်းမှုကို ရှာဖွေနိုင်သည်၊ ထို့ကြောင့် ထောက်လှမ်းမှုဒေတာ၏ စစ်မှန်မှုနှင့် ယုံကြည်စိတ်ချရမှုကို အာမခံပါသည်။NTC ထိန်းချုပ်မှုကို ချဲ့ထွင်ခြင်းသည် ညစ်ညမ်းမှုကို ဖော်ပြသည်။
RT ထိန်းချုပ်မှု (NRT) မရှိပါ
RNA ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တွင် အလွန်အန္တရာယ်များပြီး ဒေတာအရည်အသွေးနှင့် qPCR ၏ သဘာဝရန်သူအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသော လက်ကျန်ဗီဇ DNA ပါ၀င်နေနိုင်သည်၊ ထို့ကြောင့် လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများပြုလုပ်သည့်အခါ RNA ထောက်လှမ်းမှုကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက်သာ ဒီဇိုင်းထုတ်ရပါမည်။နည်းလမ်းနှစ်သွယ်ရှိပါတယ်၊ တစ်ခုက introns တစ်လျှောက် primers တွေကိုဒီဇိုင်းထုတ်ဖို့ဖြစ်ပြီး၊ နောက်တစ်ခုကတော့ DNA ကိုလုံးဝဖယ်ရှားဖို့ဖြစ်ပါတယ်၊ ဘယ်တစ်ခုကပိုကောင်းလဲ၊ နောက်မှဆွေးနွေးမယ့်။NTR ထိန်းချုပ်မှုသည် DNA ညစ်ညမ်းမှုကိုရှာဖွေရန် မှော်မှန်တစ်ခုဖြစ်သည်။ချဲ့ထွင်ခြင်းရှိလျှင် ညစ်ညမ်းမှုရှိသည်ဟု ဆိုလိုသည်။
စံနှုန်းများ
စံနှုန်းများသည် စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုကို တည်ဆောက်ရန် အသုံးပြုသည့် လူသိများသော အာရုံစူးစိုက်မှု သို့မဟုတ် မိတ္တူနံပါတ် နမူနာများဖြစ်သည်။စံနှုန်း၏တည်ငြိမ်မှုကိုသေချာစေရန်အတွက်၊ မျိုးဗီဇအပိုင်းအစကို အများအားဖြင့် plasmid တွင်ပုံတူပွားပြီး စံအဖြစ်အသုံးပြုသည်။
စံမျဉ်းကွေး
ပုံမှန်အားဖြင့် ပမာဏနှစ်ဆအလိုက် စံထုတ်ကုန်နှင့်အတူ အနည်းဆုံး အာရုံစူးစိုက်မှုအဆင့် 5 သို့ ရောစပ်ထားပြီး 5 မှတ်ကို CT တန်ဖိုးနှင့် မိတ္တူနံပါတ်၏ သြဒီနိတ်များတွင် ရေးဆွဲထားပြီး အမှတ်များကို စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုဖန်တီးရန် မျဉ်းတစ်ကြောင်းအဖြစ် ချိတ်ဆက်ထားသည်။စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုစီအတွက်၊ ၎င်း၏တရားဝင်မှုကို စစ်ဆေးရန် လိုအပ်သည်။slope value သည် –3.3 နှင့် –3.8 ကြားတွင် ကျနေပြီး အာရုံစူးစိုက်မှုတစ်ခုစီကို triplicate ဖြင့်လုပ်ဆောင်သည်။အခြားအချက်များနှင့် သိသိသာသာကွာခြားသည့်အချက်များကို ပယ်ချသင့်သည်။စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏ CT တန်ဖိုးကို စံမျဉ်းကွေးသို့ ယူဆောင်လာပြီး စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏ စကားရပ်အဆင့်ကို တွက်ချက်နိုင်သည်။
စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏ CT တန်ဖိုးကို စံမျဉ်းကွေးသို့ ယူဆောင်လာပြီး စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏ ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်ကို တွက်ချက်နိုင်သည်။
စွမ်းဆောင်ရည်နှင့် Slope
စံမျဉ်းကွေး၏ စောင်းသည် အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR ၏ ထိရောက်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
· -3.322 ၏စောင်းစောင်းသည် PCR ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် 1 သို့မဟုတ် 100% ထိရောက်ကြောင်း ညွှန်ပြပြီး PCR ထုတ်ကုန်ပမာဏသည် စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် နှစ်ဆတိုးလာသည်။
· -3.322 (ဥပမာ -3.8) ထက်နည်းသော ကုန်းစောင်းသည် PCR ထိရောက်မှုကို ညွှန်ပြသည်
· -3.322 (ဥပမာ -3.0) ထက်ကြီးသော လျှောစောက်သည် PCR ထိရောက်မှု 100% ထက် ပိုများနေပုံပေါ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်မှာ သိချင်သည်မှာ၊ PCR သံသရာတစ်ခုသည် ချဲ့ထွင်ထားသော ထုတ်ကုန်၏ နှစ်ဆကျော်ကို မည်သို့ထုတ်လုပ်နိုင်မည်နည်း။ဤအခြေအနေသည် PCR တုံ့ပြန်မှု၏ non-linear အဆင့်တွင်ဖြစ်ပေါ်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ အတိအကျမဟုတ်သောချဲ့ထွင်မှုပမာဏများစွာရှိသည်။
အရည်ပျော်မျဉ်း
qPCR ချဲ့ထွင်မှု ပြီးဆုံးပြီးနောက်၊ PCR ထုတ်ကုန်ကို အပူပေးသည်။အပူချိန်မြင့်တက်လာသည်နှင့်အမျှ၊ နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော အသံချဲ့စက်သည် တဖြည်းဖြည်း အရည်ပျော်သွားပြီး fluorescence ပြင်းထန်မှုကို လျော့ကျစေသည်။သတ်မှတ်ထားသော အပူချိန် (Tm) ရောက်သွားသောအခါ ထုတ်ကုန်အများအပြား အရည်ပျော်သွားလိမ့်မည်။မီးချောင်းများ သိသိသာသာ ကျဆင်းသွားသည်။မတူညီသော PCR ထုတ်ကုန်များတွင် မတူညီသော Tm တန်ဖိုးများနှင့် ကွဲပြားသော အရည်ပျော်သည့်အပူချိန်များ ရှိသည်၊ ထို့ကြောင့် PCR ၏ တိကျမှုကို ဖော်ထုတ်နိုင်မည်ဖြစ်သည်။
အရည်ပျော်မျဉ်း (derivative curve)
အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးသည် PCR ထုတ်ကုန်အပိုင်းအစများ၏ အခြေအနေကို ပိုမိုနားလည်သဘောပေါက်စွာပြသနိုင်သည့် အမြင့်ဆုံးမြေပုံတစ်ခုအဖြစ် ဆင်းသက်လာခြင်းဖြစ်သည်။အရည်ပျော်သည့်အပူချိန်သည် DNA အပိုင်းအစ၏ Tm တန်ဖိုးဖြစ်သောကြောင့်၊ DNA အပိုင်းအစ၏ Tm တန်ဖိုးအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသော အချို့သောကန့်သတ်ချက်များဖြစ်သည့် အပိုင်းအစအရွယ်အစား၊ GC ပါဝင်မှုစသည်ဖြင့် ယေဘုယျအားဖြင့်ပြောရလျှင် ကျွန်ုပ်တို့၏ primer ဒီဇိုင်းမူများအတိုင်း၊ချဲ့ထွင်ထားသောထုတ်ကုန်၏အရှည်သည် 80-300bp အကွာအဝေးတွင်ရှိသောကြောင့် အရည်ပျော်သည့်အပူချိန်သည် 80°C နှင့် 90°C ကြားရှိသင့်သည်။
အရည်ပျော်မျဉ်း၏အဓိပ္ပာယ်: 80°C မှ 90°C အကြားတွင် ပင်မတောင်ထွတ်သည် 80°C မှ 90°C ကြားတွင် ပေါ်လာပါက၊ fluorescent quantitative PCR သည် ပြီးပြည့်စုံသည်ဟု ဆိုလိုသည်။ပင်မတောင်ထွတ်သည် 80°C မှ 90°C အကြားတွင် ပေါ်လာပြီး 80°C အောက်တွင် အမျိုးမျိုးသော peak များပေါ်လာပါက၊ primer dimer ကို အခြေခံအားဖြင့် ယူဆပါသည်။၎င်းကိုဖြေရှင်းရန် annealing temperature ကိုတိုးမြှင့်ရန်ကြိုးစားနိုင်သည်။အကယ်၍ ပင်မတောင်ထွတ်သည် 80°C မှ 90°C ကြားတွင် ပေါ်လာပြီး အပူချိန်တက်လာသောအခါတွင် အထွေထွေအထွတ်အထိပ်သည် DNA ညစ်ညမ်းမှုရှိနေသည်ဟု အခြေခံအားဖြင့် ယူဆရပြီး စမ်းသပ်မှု၏ ကနဦးအဆင့်တွင် DNA ဖယ်ရှားရန် လိုအပ်ပါသည်။
ဟုတ်ပါတယ်၊ အောက်မှာ တစ်ခုပြီးတစ်ခု ခွဲရမယ့် ပုံမှန်မဟုတ်တဲ့ အခြေအနေတွေ ရှိပါသေးတယ်။
3. အဆင့်မြင့်အသိပညာ
qPCR လုပ်ဖို့၊ ငါ MIQE ပြောရမယ်၊အနည်းဆုံးသတင်းအချက်အလက်ထုတ်ဝေမှုအတွက်အရေအတွက်အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCRစမ်းသပ်မှုများ—အချိန်နှင့်တပြေးညီ အရေအတွက် PCR ဆိုင်ရာ ဆောင်းပါးများကို ထုတ်ဝေရန်အတွက် အနည်းဆုံး အချက်အလက်စမ်းသပ်မှုများလူတိုင်း၏နားလည်မှုကို ရိုးရှင်းစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အဓိကအကြောင်းအရာကို ရိုးရှင်းစေမည်ဖြစ်သည်။
အင်တာနက်ပေါ်တွင် MIQE ၏မူရင်းစာသားကို သင်ရှာဖွေနိုင်ပြီး အရေးအကြီးဆုံးအချက်မှာ ၎င်းကို သတ်မှတ်ပြဋ္ဌာန်းထားခြင်းဖြစ်သည်။ဆောင်းပါးတစ်ပုဒ်ကို ထုတ်ဝေသည့်အခါ ပေးဆောင်ရန် လိုအပ်သည့် ဒေတာစစ်ဆေးစာရင်း .
သုံးသပ်သူများသည် ဤအသေးစိတ်အချက်အလက်များကိုဖတ်ရှုခြင်းဖြင့် စမ်းသပ်မှု၏အရည်အသွေးကို အကဲဖြတ်နိုင်ပါသည်။အနာဂတ်စာဖတ်သူများသည် စမ်းသပ်မှုကို ထပ်ခါတလဲလဲ သို့မဟုတ် မြှင့်တင်ရန်အတွက်လည်း ၎င်းကို အသုံးပြုနိုင်သည်။
ဤစာရင်းတွင် စာရင်းတစ်ခုစီ၏ အရေးပါမှုကို E သို့မဟုတ် D ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ဘာကိုဆိုလိုတာလဲ?E: မရှိမဖြစ်လိုအပ်သောအချက်အလက်များ (တင်ပြရပါမည်);D: နှစ်လိုဖွယ်အချက်အလက်များ (တတ်နိုင်သမျှ ပေးဆောင်)။
MIQE (1)—စမ်းသပ်မှုဒီဇိုင်း
ဘွဲ့လွန်လေ့လာမှုများကို ပြီးမြောက်ပြီးနောက် ခုခံကာကွယ်မှု ပြီးဆုံးသွားသော လူဆိုးအများစုသည် စမ်းသပ်မှုတစ်ခုကို အမှီအခိုကင်းစွာ ဒီဇိုင်းရေးဆွဲနည်း၊ ၎င်းတို့၏ မှတ်စုစာအုပ်များကို ဖွင့်ကာ ဆရာပြောထားသည့်အတိုင်း လုပ်ဆောင်ရမည်ကို မသိကြပေ။ရလဒ်အနေဖြင့် စမ်းသပ်မှုပုံစံသည် တင်းကျပ်ခြင်းမရှိသဖြင့် ဤပုံနှင့် ထိုပုံကို ပုံဖော်လိုသည်ဟု မဂ္ဂဇင်း၏ အယ်ဒီတာဌာနမှ ပြောကြားသဖြင့် ကြောင်တက်တက်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ဤကဲ့သို့ မိုက်မဲမှုများ ပြုလုပ်ကြသည် ။
အိမ်နှင့်ပိုနီးသည်၊ စမ်းသပ်မှု၏ပထမနိယာမသည်ဆုံးဖြတ်ရန်ဖြစ်သည်။စမ်းသပ်မှု ယုတ္တိဗေဒ၏ ခိုင်မာမှု.အခြေခံအကျဆုံးအချက်မှာ စမ်းသပ်မှုဒီဇိုင်းဖြစ်ပြီး၊ စမ်းသပ်မှုဒီဇိုင်းနှင့်ပတ်သက်သော အရေးကြီးဆုံးအချက်မှာ ပစ်မှတ်နမူနာ၊ ရည်ညွှန်းနမူနာ (ထိန်းချုပ်မှု) နှင့် ထပ်ခါတလဲလဲ အကြိမ်အရေအတွက်တို့ကို သတ်မှတ်နည်း၊ သို့မှသာ စမ်းသပ်မှုဒေတာကို ကိုးကား၍ နှိုင်းယှဉ်ကာ ယုံကြည်နိုင်စေရန် ဖြစ်သည်။
ပစ်မှတ်နမူနာကုသမှုတစ်ခုပြီးနောက် ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇကို ထောက်လှမ်းရန်လိုအပ်သည့်နမူနာကို ရည်ညွှန်းသည်။အကိုးအကားနမူနာဇီဝဗေဒတွင် အရိုင်းအမျိုးအစားဟု မကြာခဏ ရည်ညွှန်းလေ့ရှိသော မည်သည့်ကုသမှုမှ မပါဘဲ နမူနာဖြစ်သည်။
စမ်းသပ်ပုံတူများအလွန်အရေးကြီးပါသည်။ယေဘူယျအားဖြင့်၊ ဖွဲ့နွဲ့ပုံတူသည့် အရေအတွက်သည် သုံးမျိုးထက်ပိုရပါမည်။ဇီဝပုံတူပွားခြင်းဆိုသည်မှာ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာပုံသဏ္ဍာန်နှင့်နည်းပညာဆိုင်ရာပုံတူပွားခြင်းဟူသည့်အရာကို ပိုင်းခြားရန် လိုအပ်ပါသည်။
ဇီဝပုံစံတူများ: မတူညီသောပစ္စည်းများ (အချိန်၊ အပင်များ၊ အတွဲများ၊ တုံ့ပြန်မှုပန်းကန်များ) ဖြင့် ပြုလုပ်ထားသော တူညီသော အတည်ပြုစမ်းသပ်မှု။
ဇီဝပွား
ငရုတ်ကောင်း ပိုးသတ်ဆေး ကုသနည်းကို ဥပမာအနေနဲ့ ကြည့်ရအောင်။ကျွန်ုပ်တို့သည် ABC ၏အပင်သုံးပင်တွင် ပိုးသတ်ဆေးဖြန်းချင်သည်၊ ထို့နောက် ABC ၏အပင်သုံးမျိုးသည် ဇီဝမျိုးပွားသုံးမျိုးဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့သည် မတူညီသောပစ္စည်းများဖြင့်ပြုလုပ်သော တူညီသောအတည်ပြုစမ်းသပ်မှုဖြစ်သည်။သို့သော် စမ်းသပ်မှုတစ်ခုအနေနှင့်၊ ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုလိုအပ်သည်မှာ သေချာသောကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့သည် အပင် A ၏စမ်းသပ်အုပ်စုဖွဲ့ရန် အပင် A ၏အကိုင်းအခက်များထဲမှတစ်ခုကို ဖြန်းနိုင်ပြီး ထိန်းချုပ်အုပ်စုဖွဲ့ရန် အပင် A ၏အခြားအကိုင်းအခက်များကို မဖြန်းဘဲဖြန်းနိုင်သည်။B နှင့် C အတွက် အလားတူလုပ်ပါ။
နည်းပညာပုံတူများ (Technical Replicates): ၎င်းသည် လုပ်ဆောင်ချက်ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော အမှားအယွင်းများကို ရှောင်ရှားရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည့် ထပ်ခါတလဲလဲ စမ်းသပ်မှုဖြစ်ပြီး၊ အမှန်မှာ ၎င်းသည် တူညီသောပစ္စည်းတွင်ပါရှိသော ထပ်နေသောအပေါက်ဖြစ်သည်။ကုသမှုနှင့် ထိန်းချုပ်မှုနှစ်ခုစလုံးတွင် ပစ်မှတ် ဗီဇနှင့် အတွင်းရည်ညွှန်းသည့် ဗီဇ၏ ပုံတူကူးဆက်တင်များ (အနည်းဆုံး သုံးခု) ရှိရပါမည်။
နည်းပညာပိုင်းဆိုင်ရာ ထပ်ခါထပ်ခါ
ပိုးသတ်ဆေးဖြင့် ကုသထားသော ငရုတ်ကောင်းကို နမူနာအဖြစ် ထပ်မံကြည့်ပါ။အပင် A ၏ စမ်းသပ်အုပ်စုအတွက်၊ ထောက်လှမ်းပြီးနောက် ပျမ်းမျှအားယူရန်အတွက် ၎င်း၏ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇနှင့် အတွင်းပိုင်းရည်ညွှန်းချက်ဗီဇအတွက် 1၊ 2 နှင့် 3 ရှိသော PCR အပေါက်သုံးခုကို ပြုလုပ်ထားသည်။အပင်ထိန်းချုပ်မှုအတွက် A Groups ကိုလည်း ထိုနည်းအတိုင်း ဆက်ဆံသည်။အလားတူပင် B နှင့် C အပင်များအတွက် တူညီသောကုသမှုကို ပြုလုပ်ပါ။ဒါက နည်းပညာပိုင်းဆိုင်ရာ ထပ်ခါထပ်ခါပါပဲ။
မှတ်သားထိုက်ပါတယ်။ကိန်းဂဏန်းစာရင်းအင်းထဲသို့ ဝင်လာသောအရာမှာ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထပ်ခါတလဲလဲဖြစ်ပြီး နည်းပညာဆိုင်ရာ ထပ်ခါတလဲလဲလုပ်ဆောင်ခြင်းသည် စမ်းသပ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်တွင် ကျပန်းဖြစ်ရပ်များ ရှိ၊ မရှိ စမ်းသပ်ခြင်းဖြစ်ပြီး၊ ကျွန်ုပ်တို့မကြာခဏပြောလေ့ရှိသည့်အတိုင်း ၎င်းတို့၏ပျမ်းမျှရလဒ်များကို ယုံကြည်နိုင်စေရန်၊ ဆိုလိုသည်မှာ ၎င်းတို့၏ပျမ်းမျှအား တွက်ချက်ခြင်းဖြင့် အမှားများကို ရှောင်ရှားရန်ဖြစ်သည်။
အဆိုးမြင်ထိန်းချုပ်မှုများ—NTC နှင့် NRT
NTC (ပုံစံမပါသော ထိန်းချုပ်မှု)နမူနာပုံစံမပါဘဲ ထိန်းချုပ်မှုကို စမ်းသပ်သည့်အရာသည် ညစ်ညမ်းခြင်းရှိမရှိ စစ်ဆေးရန် အသုံးပြုသည်။ယေဘူယျအားဖြင့် ရေကို ပုံစံခွက်တစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုသည်။ချောင်း၏တုံ့ပြန်မှုရှိပါက၊ ၎င်းသည် ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် nucleic acid ညစ်ညမ်းမှုဖြစ်ပေါ်နေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
ဤညစ်ညမ်းမှုများမှ လာပါသည်- မသန့်ရှင်းသောရေ၊ endogenous DNA ပါရှိသော အရည်အသွေးမပြည့်မီသော ဓာတ်ပစ္စည်းများ၊ primer ညစ်ညမ်းမှု၊ ဓာတ်ခွဲခန်းသုံးပစ္စည်းများ ညစ်ညမ်းမှု၊ aerosol ညစ်ညမ်းမှု စသည်ဖြင့်၊ RNase scavengers နှင့် RNase inhibitors ကို အသုံးပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။Aerosol ညစ်ညမ်းမှုသည် ရှာဖွေရန် အခက်ခဲဆုံးဖြစ်သည်။သင့်ဓာတ်ခွဲခန်းသည် လေထုထဲတွင် nucleic acid အမျိုးမျိုးဖြင့် ဆိုင်းငံ့ထားသော မီးခိုးမြူများနှင့်တူသည်ဟု မြင်ယောင်ကြည့်ပါ။
NRT (No-Reverse Transcriptase)reverse transcription မပါဘဲထိန်းချုပ်မှုသည် gDNA အကြွင်းအကျန်များ၏ထိန်းချုပ်မှုဖြစ်သည့်အနုတ်သဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှုအဖြစ်ပြောင်းပြန်မဟုတ်သော RNA ဖြစ်သည်။
မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုကိုလုပ်ဆောင်သောအခါ၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူပြီးနောက် cDNA ပမာဏကိုရှာဖွေခြင်းဖြင့် RNA ပမာဏကိုရှာဖွေတွေ့ရှိသည်။RNA သန့်စင်သောအခါတွင် gDNA အကြွင်းအကျန်ရှိနေပါက၊ ရရှိသောအမှန်တကယ်ရလဒ်များသည် gDNA နှင့် cDNA ဖြစ်သောကြောင့်၊ ၎င်းသည် စမ်းသပ်မှုရလဒ်များတွင် အမှားအယွင်းများဖြစ်စေသည်။စုစည်းမှုအဆင့်တွင်၊ cDNA တစ်ခုတည်းသာမက၊ RNA ထုတ်ယူစဉ်အတွင်း gDNA ကို လုံးဝဖယ်ရှားရန် လိုအပ်သည်။
MIQE (2)—နမူနာအချက်အလက်
နမူနာအချက်အလက် ဆိုသည်မှာ qPCR နှင့် ပတ်သက်သော ဆောင်းပါးတစ်ပုဒ်ကို ထုတ်ဝေသည့်အခါ၊ ဆောင်းပါး၏ မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော အစိတ်အပိုင်းဖြစ်သည့် နမူနာအချက်အလက်ကို ရှင်းလင်းစွာ ရှင်းပြရမည်ဖြစ်ပါသည်။အလားတူ၊ ကျွန်ုပ်တို့နမူနာများကို လုပ်ဆောင်သည့်အခါ၊ နမူနာများ၏တရားဝင်မှုကိုသေချာစေရန် ကျွန်ုပ်တို့၏ကိုယ်ပိုင်လုပ်ဆောင်မှုများကိုလည်း ထိန်းညှိရပါမည်။
နမူနာ၏ဖော်ပြချက်သည် ရလဒ်တစ်ခုသာဖြစ်ပြီး၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် စမ်းသပ်မှုတစ်ခုလုံးအတွင်း ယူထားသောပစ္စည်းများကို ပိုမိုအာရုံစိုက်သင့်သည်။
စမ်းသပ်ပစ္စည်းများကို ရွေးချယ်ခြင်း။
သွေးနမူနာများ - လတ်ဆတ်သောသွေးကို 4 နာရီထက်မပိုစေဘဲ ရွေးချယ်ပါ။ဆဲလ်နမူနာများ - သန်စွမ်းကြီးထွားသည့်ကာလတွင် လတ်ဆတ်သောဆဲလ်များကို စုဆောင်းရန် ရွေးချယ်ပါ။တိရိစ္ဆာန်တစ်ရှူး—လတ်ဆတ်ပြီး သန်စွမ်းကြီးထွားလာသော တစ်ရှူးကို ရွေးချယ်ပါ။အပင်တစ်ရှူး - လတ်ဆတ်ပြီး နုပျိုသော တစ်ရှူးကို ရွေးချယ်ပါ။
ဤစာကြောင်းအနည်းငယ်တွင် အဓိကစကားလုံးတစ်လုံးရှိသည်ကို သတိပြုမိရမည်- fresh .
အထက်ပါနမူနာများအတွက်၊ စျေးကွက်တွင်အကောင်းဆုံး၊ ကုန်ကျစရိတ်သက်သာပြီး တည်ငြိမ်သောကိရိယာမှာ ၎င်းတို့၏ DNA နှင့် RNA တို့ကို လျင်မြန်လွယ်ကူစွာ ထုတ်ယူနိုင်သည့် Foregene ၏ကိရိယာအစုံဖြစ်သည်။
ဆဲလ်စုစုပေါင်း RNA သီးခြားခွဲထုတ်ကိရိယာ
တိရစ္ဆာန်စုစုပေါင်း RNA သီးခြားခွဲထုတ်ကိရိယာ
Plant Total RNA Isolation Kit Plus
စမ်းသပ်ပစ္စည်းများ သိုလှောင်ခြင်း။
ယေဘုယျအားဖြင့် ပြောရလျှင် အခြေအနေများ ခွင့်ပြုပါက နမူနာများကို သိမ်းဆည်းရန် ကျွန်ုပ်တို့ မထောက်ခံပါ။သို့သော် နမူနာယူပြီးနောက် ချက်ချင်းလက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများ မလုပ်ဆောင်နိုင်သော သူငယ်ချင်းများစွာရှိပြီး အချို့မှာ နိုက်ထရိုဂျင်အရည်ကန်များကို နမူနာယူရန်အတွက် လယ်ကွင်းသို့ သယ်ဆောင်ရန်ပင် လိုအပ်ပါသည်။
ဒီလို အလုပ်ကြိုးစားတဲ့ သူငယ်ချင်းအတွက်၊ ဓါတ်ကူပစ္စည်း အသုံးအဆောင်တွေကို နားမလည်ဘူးလို့ပဲ ပြောလို့ရတယ်။ယခုအခါ စားသုံးနိုင်သော ကုမ္ပဏီအများအပြားသည် RNA နမူနာများကို အခန်းအပူချိန်တွင် သိမ်းဆည်းနိုင်သည့် ဓာတ်ပစ္စည်းများကို ထုတ်လုပ်ကြပြီး ၎င်းတို့ကို အသုံးပြုရန် သင်ရွေးချယ်နိုင်သည်။သမားရိုးကျ သိုလှောင်မှုနည်းလမ်းမှာ သယ်ဆောင်ရလွယ်ကူသော နိုက်ထရိုဂျင်အရည်ပုံးငယ်ကို အသုံးပြု၍ နိုက်ထရိုဂျင်အရည် သိုလှောင်ခြင်း ဖြစ်သည်။နမူနာကို ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ ပြန်ယူပြီးနောက် -80°C ရေခဲသေတ္တာထဲတွင် သိမ်းဆည်းပါ။
RNA ပါ၀င်သည့် စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ စကားလုံးခြောက်လုံးစာမူကို လိုက်နာရမည်-အပူချိန်နိမ့်ခြင်း၊ အင်ဇိုင်းများမရှိခြင်း၊နှင့်မြန်သည်။ .
အပူချိန်နိမ့်ခြင်းသဘောတရားကို နားလည်ရန်လွယ်ကူသည်။အင်ဇိုင်းများမပါဘဲ၊ RNase သည်ကျွန်ုပ်တို့နေထိုင်ရာကမ္ဘာ၏နေရာတိုင်းတွင်ရှိသည် (မဟုတ်ရင်သင် HIV ကြောင့်သေလိမ့်မည်) ထို့ကြောင့်စမ်းသပ်မှုများပြုလုပ်သောအခါ RNase ကိုမည်သို့ရှောင်ရှားရန်အလွန်အရေးကြီးသောအယူအဆတစ်ခုဖြစ်သည်။မြန်၊ချိုးလို့မရတဲ့ ကွန်ဖူးမရှိဘူး၊ အရှိန်တစ်ခုတည်းနဲ့ ချိုးလို့မရဘူး.
ထို့ကြောင့် တစ်နည်းအားဖြင့် ထုတ်ယူချိန်တိုလေ၊ ကိရိယာအစုံသည် ပိုကောင်းလေဖြစ်သည်။ဘာကြောင့်ဖြစ်သလဲ။Foregene's kit က အရှိန်ကို ကောင်းကောင်းသိသောကြောင့်၊
PS: အချို့သောမိန်းကလေးများသည် လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများကို အလွန်ဂရုတစိုက်ပြုလုပ်ကြသော်လည်း နှစ်အတော်ကြာ အလုပ်လုပ်ပြီးနောက်တွင် slam dunk လောက် မကောင်းမွန်ကြပါ။သူတို့သည် ဘုရားသခင်သည် တရားမျှတမှုမရှိဟု ခံစားရကာ အခြားသူများကို ပြစ်တင်ဝေဖန်ကာ အသက်ကို ရှာဖွေနေပါသည်။တကယ်တော့ သူမ နားမလည်ခဲ့ပါ။သူသည် RNA ကို ကောင်းစွာမကာကွယ်နိုင်ခဲ့ဘဲ slam dunk ကစားသမားသည် သွက်လက်သည်။သူစမ်းသပ်မှုလုပ်တဲ့အခါ သုံးကြိမ်၊ ငါးကြိမ်နဲ့ နှစ်ပိုင်းခွဲပြီးအောင်မယ်လို့ ထင်ခဲ့ပေမယ့် စမ်းသပ်မှုကို ကောင်းကောင်းလုပ်ခဲ့ပါတယ်။
မှတ်ချက်: နှေးသည်၊ RNase ကျူးကျော်ရန် အခွင့်အလမ်းပိုများသည်။ကိုယ့်ကိုကိုယ် မြန်မြန်ဆန်ဆန်ဖြစ်အောင် ဘယ်လိုလေ့ကျင့်မလဲ။နည်းလမ်းမရှိပါ၊ များများလေ့ကျင့်ပါ။
မတူညီသောစမ်းသပ်မှုများနှင့် မတူညီသောနမူနာများအတွက်၊ စာပေများကို ပိုမိုဖတ်ရှုပြီး လုပ်ဆောင်ရန်အတွက် သင့်လျော်သောနည်းလမ်းကို ရွေးချယ်ရန် လိုအပ်သေးသည်။နမူနာစုဆောင်းခြင်းနှင့် သိမ်းဆည်းခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွက်၊ သုံးသပ်သူများသည် စာရွက်၏ယုံကြည်စိတ်ချရမှုကို ပြန်လည်သုံးသပ်နိုင်စေရန်အတွက် MIQE သည် ၎င်းကို စာရွက်ပေါ်တွင် ရှင်းလင်းစွာရေးထားရန် လိုအပ်ပြီး အံ့အားသင့်နေသော လူငယ်များအတွက်လည်း သင်၏စမ်းသပ်မှုကို ပြန်လည်ပြုလုပ်ရန် အဆင်ပြေစေပါသည်။
ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ စမ်းသပ်မှုများသည် ခက်ခဲသော်လည်း ၎င်းတို့သည် အဆင့်မြင့်သည်။သတိမထားမိရင် ကမ္ဘာကြီးကို မှောက်သွားနိုင်တယ်။ဥပမာအားဖြင့်၊ SARS ကို ဇီဝဓာတုအကျပ်အတည်းဖြစ်စေရန် သို့မဟုတ် လူပေါင်း ၁.၃ ဘီလီယံကို ကယ်တင်ရန် စပ်မျိုးဆန်များ ပြုလုပ်ခြင်း။အောက်ဖော်ပြပါပုံသည် ဓာတုဗေဒစမ်းသပ်ချက်ဖြစ်ပြီး၊ သူ၏ ကွမ်းသီးနှင့်တူသော အသွင်အပြင်ကို ကြည့်ရုံဖြင့် သင့်သုတေသနအတွက် သင်မည်မျှ ဂုဏ်ယူကြောင်း နားလည်သင့်သည်။မေ့လိုက်ပါ၊ သူ့ကို မမည်းပါစေနဲ့။
MIQE (3) - နျူကလိယအက်ဆစ်ထုတ်ယူခြင်း။
Nucleic acid ထုတ်ယူခြင်းသည် ကြီးမားသော ဖြစ်ရပ်ဖြစ်ပြီး မော်လီကျူး ဇီဝဗေဒ စမ်းသပ်မှု အားလုံးသည် nucleic acid ထုတ်ယူခြင်းဖြင့် စတင်ပါသည်။ပထမဦးစွာ၊ nucleic acid ထုတ်ယူခြင်းဆိုင်ရာ MIQE ၏အကြောင်းအရာကို ကူးယူကြပါစို့။
ဒီပုံစံကို ကြည့်ရင် အပေါ်ယံမှာ မနေနိုင်ပါဘူး။ပုံစံသည် အယူဝါဒတစ်ခုဖြစ်သည်။ထိပ်တန်းကျောင်းသားတစ်ယောက်ဖြစ်ဖို့ ဘာကြောင့်လဲလို့ မေးရမယ်။ဤဇယား၏ အဓိကအကြောင်းအရာမှာ- လိုက်ရှာခြင်း ဖြစ်သည်။သန့်ရှင်းမှု၊ ခိုင်မာမှု၊ ညီညွတ်မှုနှင့် RNA ထုတ်ယူမှုပမာဏ .
ပထမပိုင်းလုပ်ငန်းစဉ် သို့မဟုတ် တူရိယာသည် နျူကလိစ်အက်ဆစ်ထုတ်ယူသည့် အဆင့်ဖြစ်သည်။အကယ်၍ သင်သည် ထုတ်ယူရန် အလိုအလျောက် နျူကလိစ်အက်ဆစ် ထုတ်ယူသည့်ကိရိယာကို အသုံးပြုပါက (အဆင့်မြင့်၊ ဝယ်ယူမှုအတွက် ကျွန်ုပ်ထံ ဆက်သွယ်ပါ)၊ သင်သည် တူရိယာ၏ မော်ဒယ်အမည်ကို ညွှန်ပြရန် လိုအပ်ပါသည်။
အစုံ၏အမည်နှင့်
ပြောင်းလဲမှုအသေးစိတ်အတွက် မည်သည့်ပစ္စည်းကိရိယာကို အသုံးပြုခဲ့သနည်း၊ အထူးဓာတ်ပေါင်းထည့်ထားသည့် သို့မဟုတ် အထူးလုပ်ဆောင်မှုများအား အခြားသူများက သင့်စမ်းသပ်မှုကို လွယ်ကူစွာ ပြန်လုပ်နိုင်ရန် ရှင်းလင်းစွာ ရှင်းပြသင့်သည်။
လူအချို့သည် အထူးနမူနာများကို ထုတ်ယူသောအခါတွင် အချို့သော အထူးဓာတ်ပစ္စည်းများကို ပေါင်းထည့်ကြပြီး၊ ဤအရာသည် ၎င်းတို့၏ လျှို့ဝှက်လက်နက်ဖြစ်သည်ဟု ယူဆကာ အခြားသူများကို မပြောစေနှင့်။၎င်းကို လျှို့ဝှက်ထားစဉ်တွင် ၎င်းတို့သည် သင့်ဆောင်းပါးကို တောက်ပစေမည့် အခွင့်အရေးကို ဆုံးရှုံးစေပါသည်။မလိမ္မာပါနှင့်၊ သိပ္ပံသုတေသနတွင် အသက်ကြီးသော Zhang ထက် ရိုးသားဖို့လိုသည်၊ လိမ္မာချင်ရင် ဆောင်းပါးက မင်းကို မိုက်မဲစေလိမ့်မယ်။
Kit ၏ ထုတ်ကုန်နံပါတ်ကို မှတ်ထားရမည်။သင် kit ကို မှာ ပြီး ဆောင်းပါး ရေး တဲ့ အခါ .ပစ္စည်းအစုံတွင် ယေဘူယျအားဖြင့် ဂဏန်းနှစ်လုံးရှိသည်- ကြောင်—ကက်တလောက်နံပါတ် (ထုတ်ကုန်နံပါတ်၊ ဆောင်းပါးနံပါတ်), Lot—ထုတ်ကုန်နံပါတ် (မည်သည့်အသုတ်မှ ထုတ်ကုန်ကို ညွှန်ပြရန်အသုံးပြုသည်)။
ထို့အပြင်၊ ဇီဝဓာတုဗေဒပစ္စည်းများကို မှာယူသည့်အခါ CAS နံပါတ်ကို မကြာခဏအသုံးပြုလေ့ရှိပြီး ၎င်းကို အတူတကွ လူသိများစေပါမည်။CAS နံပါတ်သည် ဓာတုဆေးဝါးအသစ်တစ်ခုစီအတွက် American Chemical Society မှပေးသော နံပါတ်ဖြစ်သည်။ယေဘုယျအားဖြင့် ဂဏန်းသုံးလုံးကို ဒက်ရှ်တစ်ခုဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။Rushui ၏ CAS နံပါတ်: 7732-18-5။ဓာတုပစ္စည်းများတွင် နာမည်အမျိုးမျိုးရှိသော်လည်း CAS နံပါတ်သည် ထူးခြားသည်။ဆေးကို မှာယူသည့်အခါ၊ ၎င်း၏ CAS နံပါတ်ကို ဦးစွာ စစ်ဆေးနိုင်ပါသည်။
အိမ်နဲ့ ပိုနီးတယ်၊ ဘာကြောင့် ဒါတွေကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ဖော်ပြရသလဲ။အမှန်မှာ၊ ၎င်းသည် RNA ထုတ်ယူခြင်း၏ အရည်အသွေးကိုလည်း စစ်ဆေးရန်ဖြစ်သည်။တူရိယာများနှင့် ပစ္စည်းကိရိယာများအသုံးပြုခြင်းသည် RNA ထုတ်ယူမှုကို ပိုမိုတသမတ်တည်းဖြစ်စေမည်ဖြစ်သည်။သာမာန်ဓာတ်ခွဲခန်းများ၏ ထုတ်ယူမှုအတိုင်းအတာသည် ကြီးမားခြင်းမရှိသည့်အပြင် အစုံလိုက်ဖြင့် ရရှိနိုင်သည်။
DNase သို့မဟုတ် RNase ကုသမှုအသေးစိတ်
fluorescent quantitative PCR ၏အရေးကြီးသောပြဿနာမှာ DNA ညစ်ညမ်းမှုကိုတားဆီးရန်နှင့်ညစ်ညမ်းမှုရှိပါကစမ်းသပ်မှုမလုပ်ပါနှင့်။ထို့ကြောင့်၊ စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်ရှိ DNA ကို လုံးလုံးနှင့် လုံးလုံးလျားလျား ဖယ်ရှားလိုက်ကြောင်း သက်သေပြနိုင်ရန် သင် DNA ကို စီမံဆောင်ရွက်ရာတွင် အသုံးပြုသည့် လုပ်ငန်းစဉ်ကို ဖော်ပြရန် လိုအပ်ပါသည်။schematic diagram ဖြင့်ကိုယ်စားပြုသည်။
RNA နှင့် DNA ၏ ဇယားကွက်
ယေဘူယျအားဖြင့်၊ DNA ဖယ်ရှားခြင်းနည်းလမ်းသည် ထုတ်ယူပြီးနောက် RNA ကို DNA ဖြင့် ကုသခြင်း ဖြစ်သည်။သို့သော် ဤနည်းလမ်းများသည် ရှေးကျသော နည်းလမ်းများဖြစ်သည်။စီးပွားဖြစ် RNA ထုတ်ယူသည့်ကိရိယာများသည် ထုတ်ယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း DNA ကို DNase မထည့်ဘဲ ဖယ်ရှားနိုင်ခဲ့သည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ Foregene မှ အတွဲများ။
မှတ်ချက်: RNA ထုတ်ယူစဉ်အတွင်း DNA ကို ဖယ်ရှားခြင်းသည် အလွန်အန္တရာယ်များသော အစွယ်နှစ်ထပ်ဓားဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် RNA ထုတ်ယူခြင်း၏ လည်ပတ်ချိန်ကို ရှည်လျားစေပြီး RNA ပြိုကွဲနိုင်ခြေကို တိုးစေသည်။အခြေခံအားဖြင့်၊ ၎င်းသည် RNA အထွက်နှုန်းနှင့် သန့်ရှင်းမှုအကြား အပေးအယူတစ်ခုဖြစ်သည်။
ထို့အပြင်၊ စီလီကာအခြေခံ စုပ်ယူမှုကော်လံတွင် ထည့်ထားသော DNase ပမာဏသည် အလွန်သေးငယ်ပြီး အကျိုးသက်ရောက်မှုရရှိရန် အရည်အသွေးမြင့် DNase ကို အသုံးပြုရပါမည်။မသင့်လျော်သော DNase ကို လျင်မြန်ပြီး လုံးလုံးချေဖျက်နိုင်မည်မဟုတ်ပေ။၎င်းသည် ကုန်သည်၏ နည်းပညာဆိုင်ရာ အဆင့်စမ်းသပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။ဟုတ်ပါတယ်၊၊ DNA ကို DNase မပါဘဲဖယ်ရှားနိုင်သည်ဟုဝါကြွားသောပိုပြီးထူးဆန်းသောကုန်သည်များရှိသည်။DNA ကို DNase မပါဘဲ လုံးလုံးလျားလျား ဖယ်ရှားနိုင်သည်ဟု ကြွားလုံးထုတ်သူတိုင်းသည် အရူးတစ်ယောက်ဟု ဆိုနိုင်ပါသည်။DNA သည် အတော်လေး တည်ငြိမ်သော နှစ်ထပ်သော တည်ဆောက်ပုံဖြစ်ပြီး၊ စကားပြောခြင်းနှင့် ရယ်မောရုံမျှဖြင့် ဖယ်ရှား၍မရပါ။
ညစ်ညမ်းမှုအကဲဖြတ်ခြင်း။
အကဲဖြတ်သည့်နည်းလမ်း- electrophoresis ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်း၊ 1% agarose၊ 6V/cm၊ 15min၊ 1-3 ul တင်ခြင်း
Nucleic acid ပမာဏခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
များသောအားဖြင့် UV spectrophotometer ဖြင့်တိုင်းတာသည်။OD260၊ OD280 နှင့် OD230 တို့၏ တန်ဖိုးသုံးမျိုး၏ အဓိပ္ပါယ်ကို ဦးစွာ လူကြိုက်များပါရစေ။
· OD260nm- ၎င်းသည် nucleic acid ၏ အမြင့်ဆုံးစုပ်ယူမှုအထွတ်အထိပ်၏ စုပ်ယူမှုလှိုင်းအလျားဖြစ်ပြီး အကောင်းဆုံးတိုင်းတာသည့်တန်ဖိုးမှာ 0.1 မှ 1.0 အထိဖြစ်သည်။မဟုတ်ပါက နမူနာကို အကွာအဝေးအတွင်း ယူဆောင်လာစေရန်၊
· OD280nm- ၎င်းသည် ပရိုတင်းနှင့် ဖီနိုလစ်ဒြပ်ပစ္စည်းများ၏ အမြင့်ဆုံးစုပ်ယူမှုအထွတ်အထိပ်၏ စုပ်ယူမှုလှိုင်းအလျားဖြစ်သည်။
· OD230nm - ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ်စုပ်ယူမှုအမြင့်ဆုံး၏ စုပ်ယူမှုလှိုင်းအလျားဖြစ်သည်။
ထို့နောက်၊ ညွှန်ပြချက်တစ်ခုစီ၏ အခန်းကဏ္ဍအကြောင်း ဆွေးနွေးကြပါစို့။A260 အတွက်၊ ၎င်းကို nucleic acid ၏ အထွက်နှုန်းကို တိုင်းတာရန် အသုံးပြုနိုင်သည်။OD260=1၊ dsDNA=50μg/ml၊ ssDNA=37μg/ml၊ RNA=40μg/ml။
သန့်ရှင်းစင်ကြယ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အများအားဖြင့်တွေ့ရသော အချိုးအစားများကို ကြည့်ရန် လိုအပ်သည်- OD260/280 နှင့် OD260/230။
· သန့်စင်သော DNA- OD260/280 သည် ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 1.8 နှင့် ညီမျှသည်။၎င်းသည် 1.9 ထက် ကြီးသောအခါ၊ ၎င်းသည် RNA ညစ်ညမ်းမှုရှိကြောင်း ညွှန်ပြပြီး ၎င်းသည် 1.6 ထက်နည်းသောအခါ၊ ၎င်းသည် ပရိုတင်းနှင့် ဖီနော ညစ်ညမ်းမှုရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
· Pure RNA: 1.7
· OD260/230- DNA သို့မဟုတ် RNA ဖြစ်စေ၊ ရည်ညွှန်းတန်ဖိုးသည် 2.5 ဖြစ်သည်။2.0 ထက်နည်းပါက သကြား၊ ဆားနှင့် အော်ဂဲနစ်ပစ္စည်းများ ညစ်ညမ်းမှုရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
RNA သမာဓိ
RNA ၏ သမာဓိကို တိုင်းတာရန် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ယေဘုယျအားဖြင့်၊ 28S နှင့် 18S RNA အကြား တောက်ပမှုသည် နှစ်ပိုင်းဆက်နွယ်မှုရှိမရှိ စစ်ဆေးရန် RNA denaturation gel စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။တတိယတီးဝိုင်း 5S ပေါ်လာသောအခါ၊ ကျောရိုးမဲ့များမှလွဲ၍ RNA သည် စတင်ပြိုကွဲသွားသည်ဟု ဆိုလိုသည်။
RNA အရည်အသွေး အကဲဖြတ်ခြင်းအတွက် ဒေတာ- အထက်ဖော်ပြပါ စစ်ဆေးမှုများအပြင်၊ RNA သမာဓိရှိမှုဆိုင်ရာ စမ်းသပ်မှုများဖြစ်သည့် Experion အလိုအလျောက် အီလက်ထရိုဖိုရစစ်စနစ်၏ RQI သမာဓိရှိမှု စမ်းသပ်မှုကဲ့သို့သော အဆင့်မြင့်ကိရိယာ စမ်းသပ်မှုများလည်း ရှိသေးသည်။
သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနတွင် fluorescent quantitative PCR သည် ပစ်မှတ် gene နှင့် internal reference gene အကြား နှိုင်းယှဉ်ချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။ထို့ကြောင့်၊ RNA နမူနာ ထိန်းသိမ်းခြင်း၊ RNA ထုတ်ယူခြင်း စသည်တို့တွင်၊ အဓိက ရည်မှန်းချက်မှာ RNA ၏ ခိုင်မာမှုကို သေချာစေရန် ဖြစ်သည်။
RNA ၏ သမာဓိသည် ပစ်မှတ် ဗီဇနှင့် အတွင်းပိုင်း ကိုးကားသည့် ဗီဇကြား ချိန်ခွင်လျှာအပေါ် သက်ရောက်ပုံကို အောက်ပါပုံမှ အလွယ်တကူ နားလည်နိုင်ပါသည်။ပျက်စီးသွားခြင်းသည် အတွင်းရည်ညွှန်းဗီဇ၏ မပြည့်စုံမှုဖြစ်စေ သို့မဟုတ် ပစ်မှတ်ဗီဇ၏ မပြည့်စုံမှုဖြစ်စေသည်ဖြစ်စေ ၎င်းသည် ဒေတာအပေါ် ကြီးမားသောအကျိုးသက်ရောက်မှုရှိစေမည်ဖြစ်သည်။
ပစ်မှတ် ဗီဇ နှင့် ရည်ညွှန်း ဗီဇ ၏ ဇယားကွက် သည် မမှန်ပါ။
Inhibition စမ်းသပ်ခြင်း (CT တန်ဖိုးကို မြင့်မားသော သို့မဟုတ် နိမ့်သောအာရုံစူးစိုက်မှု သို့မဟုတ် အခြားအခြေအနေများတွင် ဖိနှိပ်ထားခြင်းရှိမရှိ)
ဤကိန်းဂဏန်းကို နမူနာအဖြစ် ကောက်ချက်ငါးခု၏ Ct တန်ဖိုးများသည် အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်။မျဉ်းကွေးများကြားရှိ CT တန်ဖိုးများ ဖြန့်ဝေမှုသည် မညီမညာဖြစ်ပြီး PCR တားဆီးမှုဖြစ်သည့် မြင့်မားသောနှင့် နိမ့်သောပါဝင်မှုအောက်တွင် နှောင့်နှေးနေပါသည်။
အဓိကအချက်- RNA ထုတ်ယူမှုလုပ်ငန်းစဉ်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မှားယွင်းသောအယူအဆများကို စွန့်လွှတ်ကာ မှန်ကန်သည့်အရာများကို ဖော်ထုတ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
မှားယွင်းသော အယူအဆမှာ- RNA ထုတ်ယူခြင်းသည် အထွက်နှုန်းကို လိုက်ရုံသာဖြစ်ပြီး RNA ပမာဏ ပိုကြီးလေလေ ပိုကောင်းလေဟု တွေးဆမိပါသည်။အမှန်တော့၊ ပမာဏကို တိုင်းတာတဲ့အခါမှာ မျိုးဗီဇအရေအတွက်က သိပ်မကြီးဘူးဆိုရင် RNA များများစားစား မလိုအပ်ပါဘူး။သင်ထုတ်ယူသည့် RNA ပမာဏသည် လုံလောက်သည်ထက် ပိုနေပါသည်။
မှန်ကန်သော အယူအဆမှာ-RNA ထုတ်ယူမှုသည် သန့်ရှင်းမှု၊ ခိုင်မာမှုနှင့် ညီညွတ်မှုကို လိုက်လျောညီထွေရှိသင့်သည်။.သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှုသည် နောက်ဆက်တွဲ ပြောင်းပြန်ကူးယူမှုကို ဟန့်တားခြင်းမရှိကြောင်းနှင့် ဒေတာ DNA ကြောင့် ထိခိုက်မည်မဟုတ်ကြောင်း သေချာစေနိုင်သည်။Integrity သည် ပစ်မှတ် sequences နှင့် internal references များ၏ ချိန်ခွင်လျှာကို သေချာစေသည်။တစ်သမတ်တည်းရှိခြင်းသည် တည်ငြိမ်သောနမူနာတင်ခြင်းကို သေချာစေသည်။
MIQE (4) - ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်း
အထင်အမြင်လွဲခြင်း။: ပိုမိုမြင့်မားသောနမူနာထုထည်ကိုလိုက်စားခြင်း။
မှန်ကန်သော အယူအဆ: လိုက်လျောညီထွေရှိမှု (တည်ငြိမ်မှု) ကိုလိုက်၍ RNA တင်သည့်ပမာဏကိုမခွဲခြားဘဲ၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ထိရောက်မှုမှာ တစ်သမတ်တည်းရှိနေမည်ဖြစ်ပြီး၊ cDNA ၏ကွာခြားချက်များသည် mRNA တွင်ကွဲပြားမှုများကို အမှန်တကယ်ထင်ဟပ်နိုင်ကြောင်းသေချာစေပါသည်။
ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို schematic diagram ဖြင့် ရှင်းပြသည်-
ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြမှု ထိရောက်မှု၏ ဇယားကွက် ဇယားသည် မမှန်ပါ။
ပထမဦးစွာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်နှင့် PCR လုပ်ငန်းစဉ်အကြား ခြားနားချက်ကို နားလည်ရန် လိုအပ်ပါသည်။PCR သည် များပြားလှသော အပူပေးခြင်း နှင့် လိမ်းကျံခြင်း လုပ်ငန်းစဉ်များကို ခံယူပြီး ပစ်မှတ်အပိုင်းအစသည် အဆတိုးလာသည် ။reverse transcription သည် ဤလုပ်ငန်းစဉ်မပါဝင်သော်လည်း၊ reverse transcription သည် အမှန်တကယ်တွင် တစ်ခုမှတစ်ခုသို့ RNA အပိုင်းအစများစွာကဲ့သို့ replication process အတွင်း၊
cDNA သတင်းအချက်အလက် အပိုင်းအစများစွာကို ရရှိနိုင်သောကြောင့် ယခုအချိန်တွင် အပိုင်းအစများ ကြီးမားသော သေးငယ်သော အပိုင်းအစများကို ပြောင်းပြန်ကူးယူထားပြီး အပိုင်းအစတစ်ခုပေါ်တွင် အာရုံစိုက်ရန် မဖြစ်နိုင်သောကြောင့် ဖြစ်ပါသည်။RNA ပမာဏအတော်လေးနည်းသောကြောင့်၊ ရရှိသော cDNA ပမာဏသည် ချဲ့ထွင်မှုအကျိုးသက်ရောက်မှုရှိသော PCR နှင့်မတူဘဲ အနည်းငယ်သေးငယ်သောကြောင့်၊ အခြေခံအားဖြင့် သိရှိရန် မဖြစ်နိုင်ပါ။
cDNA electrophoresis ရလဒ်များ
ဒုတိယအနေနှင့်၊ အကောင်းဆုံးအားဖြင့်၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြခြင်းကို တစ်ပုံမှတစ်ပုံလုပ်ဆောင်သည်၊ သို့သော် မည်သည့်ကုမ္ပဏီမှမဆို ပြောင်းပြန် စာသားမှတ်တမ်းသည် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုကို မရရှိနိုင်ပါ။အခြေခံအားဖြင့်၊ ပြောင်းပြန်စာသားမှတ်တမ်းအများစု၏ထိရောက်မှုသည် 30 မှ 50% ကြားရှိသည်။အကယ်၍ ဤအခြေအနေမျိုးတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပုံတွင်မြင်လိုသည့်အရာဖြစ်သည့် တည်ငြိမ်သောပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြမှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို ပို၍နှစ်သက်ပါသည်၊ 3 RNA များသည် 2 cDNAs၊ 6 RNAs သည် 4 cDNAs ရရှိသည်၊ ထို့ကြောင့်နမူနာမည်မျှပင်တင်နေပါစေ၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြခြင်းစွမ်းဆောင်ရည်သည် အတော်လေးတည်ငြိမ်ပါသည်။ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြမှု စွမ်းဆောင်ရည် မတည်မငြိမ်ဖြစ်ပြီး အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားသည့် အခြေအနေကို ကျွန်ုပ်တို့ မမြင်လိုပါ။
ထို့ကြောင့်၊ ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြခြင်း၏ စွမ်းဆောင်ရည် တည်ငြိမ်မှုရှိမရှိကို မည်သို့စစ်ဆေးရမည်နည်း။နည်းလမ်းသည် အလွန်ရိုးရှင်းသည်၊ နှိုင်းယှဉ်စမ်းသပ်မှုတစ်ခုပြုလုပ်ရန်သာလိုသည်- တစ်ခုသည် RNA ၏နှစ်ဆဖျန်ဖြေပြီးနောက် cDNA သို့ပြန်ပြောင်းရန်၊ နောက်တစ်ခုသည် cDNA သို့ပြောင်းပြန်ကူးယူပြီးနောက်နှစ်ဆပိုမိုဖျတ်လတ်စေရန်၊ ထို့နောက်ရရှိသော slope ကိုကြည့်ရန် qPCR ပြုလုပ်ပါ။ထိပ်တန်းကျောင်းသားတစ်ယောက်အနေဖြင့် ၎င်းကို စက္ကန့်ပိုင်းအတွင်း နားလည်သင့်သည်။အောက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း
ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ ထိရောက်မှု တည်ငြိမ်မှုရှိမရှိ စမ်းသပ်ရန် RNA နှင့် cDNA ၏ ပျော့ပြောင်းခြင်း။
Reverse transcriptase နှင့် အစုံ
ပြီးပြည့်စုံသော fluorescent quantitative PCR တွင် အလွန်ကောင်းမွန်သော reverse transcriptase နှင့် kit ကို မည်သို့လုပ်ဆောင်နိုင်မည်နည်း။Reverse transcriptase ကို ရင်းမြစ်အရ AMV သို့မဟုတ် အမျိုးအစား နှစ်မျိုး ခွဲခြားထားသည်။M-MLV၊ သူတို့ရဲ့စွမ်းဆောင်ရည်က ဇယားမှာပြထားတဲ့အတိုင်းပါပဲ။
RNase H လှုပ်ရှားမှု
RNase H သည် Ribonuclease H ဖြစ်ပြီး၊ တရုတ်အမည် ribonuclease H သည် DNA-RNA ပေါင်းစပ်ကွင်းဆက်တွင် RNA ကို အထူးပြုဟိုက်ဒရိုဘိုနူကလိတ်ပေးနိုင်သော endoribonuclease ဖြစ်သည်။RNase H သည် တစ်ခုတည်းသောသောင်တင် သို့မဟုတ် နှစ်ထပ်သော DNA သို့မဟုတ် RNA တွင် phosphodiester နှောင်ကြိုးများကို hydrolyze လုပ်၍မရပါ၊ ဆိုလိုသည်မှာ ၎င်းသည် ကြိုးမျှင် သို့မဟုတ် နှစ်ထပ်သော DNA သို့မဟုတ် RNA ကို မချေဖျက်နိုင်ပါ။cDNA ၏ ဒုတိယကြိုးကို ပေါင်းစပ်ရာတွင် အသုံးများသည်။
ဒါဟာ ထူးဆန်းတဲ့အရာပါ။reverse transcriptase တွင် RNase H လုပ်ဆောင်ချက် ရှိသည် ဟု ဆိုသည်၊ reverse transcriptase တွင် RNase H ပါ၀င်သည် မဟုတ်ဘဲ RNase H ကို reverse transcriptase မှ ခွဲထုတ်ရန် မဖြစ်နိုင်ကြောင်း၊ အချို့သော အုပ်စုများ၏ ပုံစံပြောင်းပြန် transcriptase ကြောင့် ဤလုပ်ဆောင်ချက်သည် reverse transcriptase ကြောင့်ဖြစ်နိုင်သည်။
ထို့ကြောင့်၊ AMV ၏ မြင့်မားသော ပြောင်းပြန် ကူးယူဖော်ပြမှု ထိရောက်မှု မည်သို့ပင်ရှိစေကာမူ ၎င်း၏ RNase H လုပ်ဆောင်ချက်သည် cDNA ၏ အထွက်နှုန်းကို လျော့နည်းစေသည်။ဟုတ်ပါတယ်၊ ဓါတ်ပစ္စည်းထုတ်လုပ်သူများသည် cDNA ၏အထွက်နှုန်းကိုတိုးမြင့်ရန်တတ်နိုင်သမျှပြောင်းပြန် transcriptase တွင် RNase H လုပ်ဆောင်ချက်ကိုဖယ်ရှားပစ်ရန်သူတို့၏ထုတ်ကုန်များကိုအဆက်မပြတ်ကောင်းမွန်အောင်လုပ်ဆောင်နေပါသည်။
လောင်စာအပူချိန်
မတူညီသောအပူချိန်တွင် RNA ၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံ
မတူညီသောအပူချိန်တွင် RNA ၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံကိုကြည့်ပါ၊ အတိအကျအပူချိန်နှင့် ဆားပါဝင်မှုအခြေအနေများအောက်တွင် ပစ်မှတ်အပိုင်းအစ၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံကိုဆုံးဖြတ်ရန် mFold အွန်လိုင်းတူးလ်ကိုအသုံးပြုပါ။55°C တွင်၊ RNA ၏ ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံသည် အလွန်ရှုပ်ထွေးနေဆဲဖြစ်ပြီး၊ ပြောင်းပြန် transcriptase အလုပ်မလုပ်နိုင်ပါ၊ အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံကို 65°C အထိ အပြီးတိုင်ဖြေရှင်း၍မရပါ၊ AMV နှင့် M-MLV ၏ အကောင်းဆုံးအပူချိန်သည် ဤအပူချိန်ထက် များစွာနိမ့်နေပါသည်။
ဘာလုပ်မလဲ?အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် တန်းပလိတ်ကိုယ်တိုင်၏ ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်မှုဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် primer နှင့် reverse transcriptase နှင့် template အကြား ပြင်းထန်သောပြိုင်ဆိုင်မှုကိုဖြစ်စေပြီး E နည်းပါးခြင်းနှင့် ထပ်တလဲလဲလုပ်ဆောင်နိုင်မှုအားနည်းခြင်းကဲ့သို့သော ပြဿနာများစွာကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။
ဘာလုပ်မလဲ?annealing temperature ကို တတ်နိုင်သမျှ တိုးအောင်သာ လုပ်ပါ။
ဓါတ်ဆားထုတ်လုပ်သူအများအပြားသည် မျိုးရိုးဗီဇအင်ဂျင်နီယာမှတဆင့် ၎င်းတို့၏ ပြောင်းပြန် transcriptase ကို မြှင့်တင်နေကြသည်။အချို့က Jifan နှင့် Aidelai ကဲ့သို့သော တုံ့ပြန်မှုအပူချိန်ကို တိုးစေပြီး အချို့မှာ အင်ဇိုင်းနှင့် RNA နမူနာပုံစံတို့ကြား ရင်းနှီးမှုကို မြှင့်တင်ရန် တက်ကြွသော RNase H အင်ဇိုင်းအုပ်စုကို ဖယ်ရှားသည်။ဆက်စပ်မှု မြင့်မားခြင်းသည် သာမညဖွဲ့စည်းပုံကို အပြိုင်အဆိုင် ညှစ်ထုတ်နိုင်ပြီး ချောမွေ့စွာ ဖတ်ရှုနိုင်ပြီး ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ ထိရောက်မှုကိုလည်း များစွာ တိုးတက်စေပါသည်။
အဓိကအချက်- Reverse transcription efficiency ၏ ညီညွတ်မှုကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေရန် (အင်ဇိုင်းများသည် ထိရောက်ရုံသာမက တည်ငြိမ်မှုရှိရပါမည်)၊ အထူးသဖြင့် ကြီးမားသော fluorescent quantitative PCR မဟုတ်ပါက နမူနာတင်ဆောင်သည့်ပမာဏထက် လုံးဝမဖြစ်နိုင်ပါ။cDNA အများအပြား။
အမျိုးမျိုးသော ထုတ်လုပ်သူ များသည် လိုက်လျောညီထွေရှိမှုကို လိုက်ရှာရာတွင်လည်း အချို့သော အားထုတ်မှုများ ပြုလုပ်ခဲ့ကြသည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ ကုမ္ပဏီအများစုသည် ယခုတွင် ပြောင်းပြန်စာသားကို စံသတ်မှတ်ကိရိယာအဖြစ် ရောင်းချရန် ထုပ်ပိုးထားပြီး၊ ယင်းသည် ကောင်းမွန်သောရွေးချယ်မှုဖြစ်သည်။
ဥပမာအားဖြင့်၊ Foregene ၏ RT Easy Series kits
RT Easy I (ပထမကြိုးမျှင် cDNA ပေါင်းစပ်မှုအစုံအတွက် Master premix)
MIQE (5) – ပစ်မှတ် ဗီဇအချက်အလက်
အပေါ်ကပုံက ရှင်းပြထားပါတယ်။
1. ထပ်ခါတလဲလဲ စမ်းသပ်မှုများအတွက် ဤဗီဇသည် ထိရောက်မှုရှိမရှိ ယေဘူယျအားဖြင့် ထပ်ခါတလဲလဲ စမ်းသပ်မှုများဖြင့် အတည်ပြုနိုင်သည်။
2. Gene ID ကို သင်သိပါသလား။
3. Gene length၊ ပစ်မှတ် gene ၏ စုစုပေါင်း အရှည်သည် ပြဿနာမရှိသည်မှာ သေချာပါသည်။primers များကို ဒီဇိုင်းဆွဲသောအခါ၊ ပိုမိုကောင်းမွန်သော ချဲ့ထွင်မှု ထိရောက်မှု ရှိစေရန်အတွက် amplicon ၏ အလျားသည် 80-200bp အကြား ရှိနေကြောင်း သေချာပါစေ။
4. Sequence Blast နှိုင်းယှဉ်မှု အချက်အလက်၊ အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို တားဆီးရန်အတွက် ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇကို genebank တွင် နှိုင်းယှဉ်ရန် လိုအပ်သည်။
5. Pseudogenes ရှိနေခြင်း။pseudogene သည် ပုံမှန် gene တစ်ခုနှင့် ဆင်တူသော DNA အမျိုးအစားတစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်း၏ ပုံမှန်လုပ်ဆောင်မှု ဆုံးရှုံးသွားပါသည်။၎င်းသည် eukaryotes ၏ မျိုးရိုးဗီဇမျိုးစုံတွင် ရှိနေတတ်သည်။များသောအားဖြင့် ψ ဖြင့် ကိုယ်စားပြုသည်။၎င်းသည် coding gene sequence နှင့် အလွန်ဆင်တူသော genome ရှိ genomic DNA မိတ္တူဖြစ်သည်။ယေဘုယျအားဖြင့် ကူးယူဖော်ပြခြင်းမပြုဘဲ ရှင်းလင်းသော ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ အဓိပ္ပါယ်မရှိပါ။
6. exons နှင့် introns တို့နှင့် ဆက်စပ်နေသော primers များ၏ အနေအထား။အစောပိုင်းနှစ်များတွင်၊ DNA ညစ်ညမ်းမှုပြဿနာကို ကျွန်ုပ်တို့ဖြေရှင်းသောအခါတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် primers၊ exons နှင့် introns များ၏ရာထူးများကို မကြာခဏအာရုံစိုက်ခဲ့ပြီး DNA ချဲ့ထွင်ခြင်းကိုရှောင်ရှားရန်အတွက် introns တစ်လျှောက် primers များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ရန် ယေဘူယျစဉ်းစားခဲ့သည်။ကျေးဇူးပြု၍ အောက်ပါပုံကိုကြည့်ပါ- အနက်ရောင်သည် အင်ထရွန်များကိုကိုယ်စားပြုသည်၊ အမျိုးမျိုးသောအပြာရောင်များသည် exons ကိုကိုယ်စားပြုသည်၊ ပန်းရောင်သည် အများအားဖြင့် primers ကိုကိုယ်စားပြုသည်၊ တောက်ပသောအနီရောင်သည် intro-spanning primers ကိုကိုယ်စားပြုသည်။
အစီအစဥ်၊ ဘယ်တော့မှ မမှန်ဘူး။
ဒါက ပြီးပြည့်စုံတဲ့ အစီအစဥ်တစ်ခုလို့ထင်ရပေမယ့် တကယ်တော့၊ ကိစ္စအများစုမှာ၊ trans-intro primers တွေဟာ စိတ်ကူးထားသလောက် မှော်ဆန်တာမဟုတ်သလို၊ အတိအကျမဟုတ်တဲ့ ချဲ့ထွင်မှုကိုလည်း ဖြစ်စေပါလိမ့်မယ်။ဒါကြောင့် DNA ညစ်ညမ်းမှုကို တားဆီးဖို့ အကောင်းဆုံးနည်းလမ်းကတော့ DNA ကို လုံးဝဖယ်ရှားပစ်ဖို့ပါပဲ။
7. ကိုက်ညီမှု ခန့်မှန်းချက်။ဤဥပမာကို ထပ်မံအသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ သတ်မှတ်ထားသော အပူချိန်နှင့် ဆားပါဝင်မှုတွင် ပစ်မှတ်အပိုင်းအစ၏ ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံကို ဆုံးဖြတ်ရန် mFold အွန်လိုင်းတူးလ်ကို အသုံးပြုပါ။
မတူညီသောအပူချိန်တွင် RNA ၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံ
အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် ပုံစံပလိတ်ကိုယ်နှိုက်၏ ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်မှုဖြစ်ပြီး၊ primer နှင့် template တွဲချိတ်ခြင်းကြားတွင် ပြင်းထန်သောပြိုင်ဆိုင်မှုဆီသို့ ဦးတည်သွားမည်ဖြစ်ပြီး primer binding ၏အခွင့်အလမ်းနည်းပါးသွားကာ E နည်းပါးခြင်းနှင့် ထပ်တလဲလဲလုပ်ဆောင်နိုင်မှုအားနည်းခြင်းကဲ့သို့သော ပြဿနာများစွာကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဟောကိန်းထုတ်ခြင်းဖြင့် ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံပြဿနာမရှိပါက၊ အလွန်ကောင်းသည်။ရှိလျှင် ကျွန်ုပ်တို့၏ နောက်ဆက်တွဲဆောင်းပါးတွင် ဤပြဿနာကို မည်သို့ဖြေရှင်းရမည်ကို အထူးဆွေးနွေးပါမည်။
MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides
fluorescent quantitative PCR အတွက်၊ သင်နေ့စဉ်ကြုံတွေ့နေရသော ပထမဆုံးအရာမှာ RNA ထုတ်ယူခြင်းဖြစ်ပြီး ဒုတိယအချက်မှာ primer ဒီဇိုင်းဖြစ်နိုင်သည်။
ပထမဦးစွာ၊ MIQE စစ်ဆေးရေးစာရင်းအရ primer ဒီဇိုင်းနှင့်ပတ်သက်သောစည်းမျဉ်းများကိုကျွန်ုပ်တို့စစ်ဆေးဆဲဖြစ်သည်။မိုက်မဲသူများသည် ရယ်မောနိုင်လောက်အောင် ရိုးရှင်းပြီး ၎င်းကို ဝါကျတစ်ကြောင်းတည်းဖြင့် ပြီးမြောက်နိုင်သည်- primer probe ၏ အစီအစဥ်နှင့် အနေအထားနှင့် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုနည်းလမ်းကို ရှာဖွေပါ။primer သန့်စင်မှုနည်းလမ်းအတွက်၊ primer synthesis သည် လက်ရှိအချိန်တွင် အလွန်စျေးပေါသည်၊ qPCR သည် PAGE နှင့်အထက် သန့်စင်ရေးနည်းလမ်းများနှင့်ထိုက်တန်ပြီး ပေါင်းစပ်မှုကိရိယာ၏အချက်အလက်များသည် အရေးမကြီးပါ။လူအတော်များများသည် primers ကို ဆယ်စုနှစ်များစွာကြာအောင် ပြုလုပ်ခဲ့ကြပြီး synthesizer သည် ABI3900 ဖြစ်ကြောင်း မသိကြပါ။
primer ဒီဇိုင်းအခြေခံမူများနှင့် ပတ်သက်၍၊ primer design software သို့မဟုတ် online tools အများစုသည် ဤပြဿနာများကို ကိုင်တွယ်ဖြေရှင်းနိုင်သောကြောင့် (အကြံပြုထားသည့် online tool primer3.ut.ee/) နှင့် primer design ၏ 99.999% ကို ကိုယ်တိုင်မလုပ်ဆောင်ပါ ကြည့်ပါ၊ စာရေးသူသည် တစ်ခါတစ်ရံတွင် primer များကို တရက်လျှင် ရာနှင့်ချီပြီး ဒီဇိုင်းထုတ်ပါသည်။
Primer များကို ဒီဇိုင်းထုတ်ပြီးနောက် အောက်ပါအချက်များကို စစ်ဆေးကြည့်ပါ။
1. 3′ အဆုံးနှင့် နီးစပ်သော ဒီဇိုင်းရေးဆွဲခြင်း- cDNA first-strand synthesis အတွက် oligo dT primers ကိုအသုံးပြုခြင်းတွင်၊ reverse transcription efficiency နှင့် RNA integrity ကိုထည့်သွင်းစဉ်းစားရာတွင်၊ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုတိုးတက်စေရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော primer များကို 3′ end အနီးတွင် ဒီဇိုင်းထုတ်ရန်လိုအပ်ပါသည်။အောက်ပါအတိုင်း ရှင်းပြရန် ပုံတစ်ပုံကို အသုံးပြုပါ (ဒါကို နားလည်ရန် နည်းလမ်းမရှိပါ)။
Primer များကို 3′ အဆုံးနှင့် နီးကပ်စွာ အဘယ်ကြောင့် ဒီဇိုင်းဆွဲသင့်သနည်း၊ ၎င်းသည် မမှန်ပါ။
2. TM တန်ဖိုး- Tm တန်ဖိုးသည် 55-65°C တွင် (exonuclease လုပ်ဆောင်ချက်သည် 60°C တွင် အမြင့်ဆုံးဖြစ်သောကြောင့်) နှင့် GC ပါဝင်မှုသည် 40%-60% ဖြစ်သည်။
3. BLAST- ဂျီနိုမ်၏ အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ရှောင်ရှားရန်အတွက် Blast အား ထပ်လောင်းအတည်ပြုချက်အတွက် အသုံးပြုရပါမည်။
MIQE(7)—qPCR လုပ်ငန်းစဉ်
1. qPCR အစုံ
MIQE ၏လိုအပ်ချက်များအရ PCR တုံ့ပြန်မှုစနစ်၏ဖွဲ့စည်းပုံပုံစံ၊ မည်သည့်ကိရိယာကိုအသုံးပြုသည်၊ ထုတ်လုပ်သူမည်သူနည်း၊ ဆိုးဆေးနည်းလမ်း သို့မဟုတ် စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုနည်းလမ်းကိုအသုံးပြုသည်ဖြစ်စေ PCR ပရိုဂရမ်ဆက်တင်များအသုံးပြုခြင်းအပါအဝင် ဆောင်းပါးပါ ပြီးပြည့်စုံသောတုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကို ရှင်းလင်းစွာဖော်ပြရပါမည်။အစုံအလင်ကို ရွေးချယ်ထားသရွေ့ အထက်ဖော်ပြပါ အချက်အလက်များကို အခြေခံအားဖြင့် ဆုံးဖြတ်ထားသည်ကို ဝါရင့်ယာဉ်မောင်းများသည် ကျိန်းသေတွေ့လိမ့်မည်။
လက်ရှိတွင်၊ fluorescent quantitative PCR kits များထုတ်လုပ်ခြင်းနှင့်ထုတ်လုပ်ခြင်းသည်အလွန်ရင့်ကျက်သောနည်းပညာတစ်ခုဖြစ်သည်။အလွန်ဆိုးရွားသော ထုတ်လုပ်သူအား သင်မရွေးချယ်သရွေ့၊ ပြဿနာများဖြစ်နိုင်ခြေမှာ မမြင့်မားသော်လည်း အချက်အချို့ကို သင့်အား မျှဝေလိုပါသေးသည်။
Hot-start Taq အင်ဇိုင်း-PCR ၏အရေးကြီးဆုံးအစိတ်အပိုင်းမှာ hot-start Taq အင်ဇိုင်းဖြစ်သည်။စျေးကွက်ရှိ hot-start အင်ဇိုင်းများကို ယေဘူယျအားဖြင့် နှစ်မျိုးခွဲခြားထားပြီး၊ တစ်မျိုးမှာ ဓာတုဗေဒနည်းအရ ပြုပြင်ထားသော hot-start အင်ဇိုင်း (၎င်းကို paraffin မြှုပ်နှံထားသည့်အတိုင်း စိတ်ကူးကြည့်နိုင်သည်) နှင့် အခြားတစ်မျိုးမှာ ပဋိပစ္စည်းမွမ်းမံမှုအတွက် hot-start enzyme (antigen-antibody binding) ဖြစ်သည်။ဓာတုပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းသည် ပူပြင်းသောစတင်အင်ဇိုင်းများ၏ အစောပိုင်းနည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။သတ်မှတ်ထားသော အပူချိန်သို့ ရောက်သောအခါ အင်ဇိုင်းသည် ၎င်း၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထုတ်လွှတ်သည်။ပဋိပစ္စည်း-မွမ်းမံထားသော hot-start အင်ဇိုင်းသည် အင်ဇိုင်း၏လုပ်ဆောင်မှုကို ဟန့်တားရန် ဇီဝဗေဒနည်းလမ်းများကို အသုံးပြုသည်။သတ်မှတ်ထားသော အပူချိန်သို့ရောက်သောအခါ၊ ပဋိပစ္စည်းသည် ပရိုတင်းအဖြစ် အသွင်ပြောင်းပြီး အသက်မဝင်တော့ဘဲ အင်ဇိုင်း၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို အသုံးချသွားမည်ဖြစ်သည်။
သို့သော်၊ ဤအရာကိုအသုံးပြုခြင်းသည် အဘယ်နည်း။ဤအခြေအနေတွင်၊ ပဋိပစ္စည်း-မွမ်းမံထားသော အင်ဇိုင်းများ၏ ထုတ်လွှတ်မှု လုပ်ဆောင်ချက်သည် ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပြုပြင်ထားသော အင်ဇိုင်းများထက် ပိုမြန်သည်၊ ထို့ကြောင့် အာရုံခံနိုင်စွမ်းအရ၊ ပဋိပစ္စည်း-မွမ်းမံထားသော အင်ဇိုင်းများသည် ဈေးကွက်တွင် အခြေခံအားဖြင့် ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပြုပြင်ထားသော အင်ဇိုင်းများ မရှိစေရန် အနည်းငယ် အားသာချက်ရှိသည်။ရှိလျှင် ဤထုတ်လုပ်သူ၏နည်းပညာသည် ထောင်စုနှစ်၏ခေတ်တွင် ဆက်လက်တည်ရှိနေပါသည်။
မဂ္ဂနီဆီယမ် အိုင်းယွန်း အာရုံစူးစိုက်မှုမဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်းအာရုံစူးစိုက်မှုသည် PCR တုံ့ပြန်မှုတွင်အလွန်အရေးကြီးသည်။သင့်လျော်သော မဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်းအာရုံစူးစိုက်မှုသည် Taq အင်ဇိုင်းလှုပ်ရှားမှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည်။အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းလွန်းပါက၊ အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားလိမ့်မည်၊အကယ်၍ အာရုံစူးစိုက်မှု အလွန်မြင့်မားပါက၊ တိကျသောမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုရှိသော အင်ဇိုင်း-ဓာတ်ပစ္စည်းများကို မြှင့်တင်ပေးမည်ဖြစ်သည်။မဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်း၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် primers များ၏ ရောနှောခြင်း၊ template နှင့် PCR ထုတ်ကုန်များ၏ အရည်ပျော်အပူချိန်ကိုလည်း ထိခိုက်စေပြီး ချဲ့ထွင်ထားသော အပိုင်းအစများ၏ အထွက်နှုန်းကို ထိခိုက်စေပါသည်။မဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်း၏အာရုံစူးစိုက်မှုကို ယေဘူယျအားဖြင့် 25mM တွင်ထိန်းချုပ်ထားသည်။ဟုတ်ပါတယ်၊ ကိရိယာကောင်းတစ်ခုအတွက်၊ မဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်း၏အာရုံစူးစိုက်မှုကို ကောင်းမွန်စွာထိန်းချုပ်ထားရပါမည်။အချို့သောကုန်သည်များသည် မဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်းအာရုံစူးစိုက်မှု၏အလိုအလျောက်ချိန်ညှိမှုအကျိုးသက်ရောက်မှုကိုရရှိစေသည့်ဓာတ်ပစ္စည်းများတွင်မဂ္ဂနီဆီယမ်အိုင်းယွန်း chelating အေးဂျင့်ကိုထည့်သွင်းကြသည်။
ရောင်ရမ်း ဆိုးဆေး အာရုံစူးစိုက်မှု-ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုလေ့ရှိသော SYBR Green သည် ရောင်ရမ်းသည့်ရောင်ရမ်းခြင်းဖြစ်ပြီး အဓိကအားဖြင့် ကြိုးနှစ်ထပ် DNA ၏အသေးအဖွဲအစပ်တွင် ချည်နှောင်ခြင်းဖြင့် fluorescence ကိုထုတ်ပေးပါသည်။ အချက်ပြ။
PS- ၎င်း၏အလင်းအာရုံခံ ဂုဏ်သတ္တိများကြောင့်၊ စျေးကွက်ရှိ ထုတ်ကုန်များကို ယေဘုယျအားဖြင့် အညိုရောင်မှိန်ဖျော့ဖျော့ပြွန်များ (အောက်ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း) ထုပ်ပိုးထားသည်။သို့သော် ဤပြဿနာကို ကြုံတွေ့ရမည်ဖြစ်သည်။နမူနာယူသည့်အခါ အရည်စို့ခြင်းရှိမရှိ ကြည့်ရန်ခက်ခဲသည်။ဤအချက်နှင့်ပတ်သက်၍၊ Qingke သည် အမှန်တကယ်တွင် အသုံးပြုရအဆင်ပြေဆုံးဖြစ်သည် (အောက်ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း) နှင့် ဖောက်ထွင်းမြင်ရသောပြွန်ကို ရောင်သောသွပ်အိတ်ဖြင့်ထုပ်ပိုးထားသည်။ထို့နောက် အလင်းရောင်နှင့် နမူနာယူခြင်းတို့ကို ရှောင်ရှားရန် အဆင်ပြေစေရန်အတွက် ၎င်းကို သံဖြူအိတ်တစ်ခုထဲသို့ ထည့်ပါ။မှန်ကန်သော ထုတ်ကုန်နံပါတ်ကို ရွေးချယ်ရပါမည်။TSE204 သည် မြက်ပင်စိုက်ချင်စေသည်။
ချောင်းဆိုးဆေး၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းလွန်းပါက၊ ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးသည် နောက်ပိုင်းအဆင့်တွင် တက်သွားမည်ဖြစ်ပြီး ပြီးပြည့်စုံမည်မဟုတ်ပါ။အာရုံစူးစိုက်မှု အလွန်မြင့်မားပါက၊ ၎င်းသည် ဆူညံသံများကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသည်။ချောင်း၏ပမာဏ PCR သည် CT တန်ဖိုးပေါ်တွင် အဓိကမူတည်သောကြောင့်၊ ချောင်းဆိုးဆေး၏အာရုံစူးစိုက်မှုကို ကောင်းမွန်စွာမချိန်ညှိပါက၊ အနိမ့်အမှတ်သည် မြင့်သောအမှတ်ထက် ပိုကောင်းပါသည်။ဟုတ်ပါတယ်၊ သင့်လျော်တဲ့ ဆိုးဆေးပါဝင်မှုက အကောင်းဆုံးပါပဲ။
ROX: ROX ဆိုးဆေးများကို ကောင်းစွာ-ကောင်းမွန်သော fluorescence အချက်ပြအမှားများအတွက် ပြင်ဆင်ရန် အသုံးပြုပါသည်။အချို့သော တူရိယာထုတ်လုပ်သူများသည် စံကိုက်ချိန်ညှိရန် လိုအပ်သော်လည်း အချို့မှာ မလိုအပ်ပါ။ဥပမာအားဖြင့်၊ Thermo Fisher Scientific ၏ အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR အသံချဲ့စက်ကို အသုံးပြုခြင်းသည် များသောအားဖြင့် 7300၊ 7500၊ 7500Fast၊ StepOnePlus စသည်တို့ အပါအဝင် စံကိုက်ချိန်ညှိမှု လိုအပ်ပါသည်။ ယေဘူယျ ကိရိယာ ညွှန်ကြားချက်များသည် ၎င်းကို ဖော်ပြပါမည်။
Foregene ၏ qPCR Mix တွင် မော်ဒယ်အမျိုးမျိုးတွင် အသုံးပြုရန် အဆင်ပြေသည့် ROX ဆိုးဆေးလည်း ပါဝင်ပါသည်။
အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR Kit-Taqman
အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုး ကုသမှု: အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို ကုသခြင်းသည် နည်းပညာပိုင်းဆိုင်ရာ ကိစ္စဖြစ်သည်။အစုံလိုက်များစွာ၏ လက်စွဲစာအုပ်များကို မည်သည့်အရာမှ မဖတ်ဖူးသော်လည်း မည်သူကမှ ဤအကြောင်းအရာကို မပြောခဲ့ပါ။တကယ်တော့ အဲဒါက အရမ်းအရေးကြီးတယ်။ဘေ့စ်များ ပေါင်းစပ်ခြင်းသည် အဓိကအားဖြင့် ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများ၏ ခိုင်ခံ့မှုအပေါ် မူတည်ပါသည်။ခိုင်ခံ့သော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများသည် ပုံမှန် ချဲ့ထွင်ခြင်းဖြစ်ပြီး၊ အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများသည် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်စေသည်။အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို ကောင်းစွာ မချေဖျက်နိုင်ပါက၊ အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ရှောင်ရှားနိုင်မည်မဟုတ်ပေ။စာရေးသူ၏နယ်ပယ်အတွင်းတွင် ကုမ္ပဏီအနည်းငယ်ကသာ ဤပြဿနာကို သတိပြုမိပါသည်။သင်ကိရိယာအစုံကိုဝယ်သောအခါ၊ သင်ရွေးချယ်လိုသောပစ္စည်းကိရိယာအတွက် ဤကိစ္စနှင့်ပတ်သက်ပြီး ဖြေရှင်းချက်တစ်ခုကို သင်ထည့်သွင်းစဉ်းစားထားခြင်းရှိမရှိကို ကိုးကားနိုင်ပါသည်။
တုံ့ပြန်မှုပမာဏ: 20-50ul စနစ်သည် ပိုအသုံးများပြီး သေးငယ်သော volume များသည် အမှားအယွင်းများ ဖြစ်စေနိုင်သည်။ယေဘူယျအားဖြင့်ပြောရလျှင်၊ အစုံလိုက်ညွှန်ကြားချက်များသည် PCR တုံ့ပြန်မှုပမာဏများကိုအသုံးပြုရန် အကြံပြုလိမ့်မည်။စမတ်ကျမနေပါနှင့် ကုန်ကျစရိတ်သက်သာရန် သေးငယ်သော အတွဲများကို အသုံးပြုပါ။ပန်းတိုင်။ကုန်သည်များက အကြံပြုထားသော ပမာဏကို အမှန်တကယ် စမ်းသပ်ပြီးဖြစ်ပြီး သေးငယ်သော ပမာဏကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော အမှားအယွင်းပြဿနာကို ၎င်းတို့ မဖြေရှင်းနိုင်ခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။
2. ထုတ်လုပ်သူနှင့် ဆောင်းပါးနံပါတ်သည် ပြွန်ပန်းကန်ပြား
fluorescent quantitative PCR ၏နိယာမကိုလူတိုင်းသိသည်။အဓိကအားဖြင့် PCR tube caps များမှတဆင့် Fluorescence စုဆောင်းခြင်းကိုလုပ်ဆောင်သည်။PCR စားသုံးနိုင်သောပစ္စည်းများကိုရွေးချယ်သောအခါ၊ အလင်းထုတ်လွှင့်မှုကောင်းမွန်ပြီး တူရိယာအတွက်သင့်လျော်သောအချက်နှစ်ချက်ကိုအာရုံစိုက်ပါ။ယေဘူယျအားဖြင့်ပြောရလျှင် ပင်မအမှတ်တံဆိပ်များ၏ ဘုတ်များနှင့် ပြွန်များသည် ကောင်းမွန်သော်လည်း လိုက်လျောညီထွေရှိသော စည်းကမ်းချက်များ၌ ဂရုတစိုက်ရွေးချယ်ရမည်ဖြစ်ပြီး မဟုတ်ပါက တူရိယာကို သင်အသုံးပြုနိုင်မည်မဟုတ်ပေ။
4. ထိပ်တန်းအဆင့် အသိပညာ
MIQE (8)—qPCR အတည်ပြုချက်
၎င်းသည် qPCR ၏ ထိပ်တန်းဦးစားပေးဖြစ်သည်။ဤနေရာ၌ သူရဲကောင်းများစွာ သဲထဲရေထဲ ကျသွားသည်။ဟုတ်ပါတယ်၊ သင်ကံကောင်းပြီး သင်လေ့လာခဲ့တဲ့ ဗီဇတွေက ရိုးရှင်းတဲ့အတွက် လေထဲမှာ ရေခဲဂူကိုဖြတ်ပြီး လွင့်မျောသွားတာလည်း ဖြစ်နိုင်တယ်။qPCR ၏ အတည်ပြုချက် အချက်အလက်သည် ဒေတာ၏ ယုံကြည်စိတ်ချရမှုကို စမ်းသပ်ရန် ရည်ရွယ်ပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် လိုအပ်သော စိစစ်ရေးအချက်အလက်များကို အောက်ပါအတိုင်း စာရင်းပြုစုထားပါသည်။
1.Specificity စမ်းသပ်မှု
ပစ်မှတ် ဗီဇချဲ့ထွင်မှု၏ တိကျသေချာမှုအား electrophoresis ပုံသည် တီးဝိုင်းတစ်ခုတည်းဟုတ်မဟုတ် စစ်ဆေးခြင်းဖြင့် စမ်းသပ်သည်။sequencing စစ်ဆေးခြင်း;အထွတ်အထိပ်မြေပုံသည် တစ်ခုတည်းဖြစ်မဖြစ် ကြည့်ရန် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေး၊အင်ဇိုင်းအစာခြေအတည်ပြုခြင်းနှင့်အခြားနည်းလမ်းများ။
ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် t ကိုအာရုံစိုက်သည်။မျဉ်းကွေးအရည်ပျော်နည်းကို အသုံးပြု၍ သီးခြားမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည်။.ယေဘူယျအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် primers ကိုဒီဇိုင်းဆွဲသောအခါ၊ ထုတ်ကုန်အပိုင်းအစ၏အရွယ်အစားသည် 80-200bp အကွာအဝေးတွင်ရှိရန်လိုအပ်သည်၊ ၎င်းသည် PCR ထုတ်ကုန်၏အရည်ပျော်အပူချိန် 80-85 °C အကွာအဝေးကိုဖြစ်စေသည်။ထို့ကြောင့်၊ အမျိုးမျိုးသော အထွတ်အထိပ်များရှိပါက၊ အတိအကျမဟုတ်သော အခြားအသံချဲ့စက်များ ရှိရပါမည်။အထွတ်အထိပ်သည် 80°C အောက်တွင် ပေါ်လာပါက၊ ၎င်းကို primer dimer ဟု ယေဘုယျအားဖြင့် ယူဆပါသည်။အထွတ်အထိပ် ၈၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်အထက်တွင် ပေါ်လာပါက၊ ၎င်းအား DNA ညစ်ညမ်းခြင်း သို့မဟုတ် အပိုင်းအစကြီးများ၏ အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်ခြင်းဟု ယေဘုယျအားဖြင့် ယူဆသည်။
မှတ်ချက်- တစ်ခါတစ်ရံတွင် 80°C တွင် တောင်ထွတ်တစ်ခုသာရှိသည်။ဒီအချိန်မှာ ဒီသဘောတရားကို လိုက်နာရမယ်။ချဲ့ထွင်မှုရလဒ်များအားလုံးသည် primer dimers ဖြစ်ဖွယ်ရှိသည်။
ပုံမှန် အရည်ပျော်မျဉ်းကွေး (အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှု မရှိသော အထွတ်အထိပ်တစ်ခု)
Problematic အရည်ပျော်မျဉ်းကွေး (spurious peaks ၏ အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှု)
【ဖြစ်ရပ်သုံးသပ်ချက်】
အဓိကအထွတ်အထိပ်ရှိသော်လည်း primer dimer သည်ပြင်းထန်သည်။
အောက်ဖော်ပြပါပုံရှိ အမြင့်ဆုံး အရည်ပျော်မျဉ်းကွေးသည် ပြီးပြည့်စုံသော စမ်းသပ်မှုတစ်ခုဟု ထင်မြင်ကာ သင့်မျက်လုံးများကို အလွယ်တကူ လှည့်စားနိုင်သော်လည်း ရလဒ်မှာ လုံးဝမှားယွင်းပါသည်။ဒီအချိန်မှာ အရည်ပျော်တဲ့ အပူချိန်ကို ကြည့်ရပါမယ်။အမြင့်ဆုံးအပူချိန်မှာ 80°C အောက်ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် လုံးဝ primer-dimer ဖြစ်သည်။
ပစ်မှတ်အပိုင်းအစမရှိ၊ primer dimers အားလုံး
ဒီမှာ အစ်ကို တားလို့မရဘူး။အောက်ဖော်ပြပါပုံသည် လူမိုက်တစ်ဦးထံ ပေးပို့ထားသော လက်ကိုင်ဖုန်းဖြင့် ရိုက်ထားသော ဓာတ်ပုံဖြစ်သည်။သူအသုံးပြုသော ဓါတ်ပစ္စည်းများသည် စက်မှုလုပ်ငန်းတွင် အသုံးများသော အမှတ်တံဆိပ်များဖြစ်သည်။သူသည် T-prefix အမှတ်တံဆိပ်တစ်ခုမှ အခြား T-prefix အမှတ်တံဆိပ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။မင်း ခန့်မှန်းပြီးပြီ ထင်ပါတယ်။ညစ်ပတ်သောလူက “ပထမပုံမှာသုံးတဲ့ ဓါတ်ဆေးက အရမ်းကောင်းပြီး အထွတ်အထိပ်က တစ်ခုတည်းပါ။နောက်ပိုင်းတွင်၊ သင်အကြံပြုထားသော ဓါတ်ပစ္စည်းများကို အသုံးပြုပြီးနောက်၊ ၎င်းသည် ရောစပ်ထားသော အထွတ်အထိပ်များဖြင့် ဒုတိယပုံကဲ့သို့ ဖြစ်လာသည်။မင်း ငါ့ကို စိတ်ဆင်းရဲအောင် လုပ်လိုက်တာ။“
ဂရပ်နှစ်ခုကို ခွဲခြားပါ။ပထမတစ်ချက်တွင်၊ တစ်ခုတွင် တောင်ထွတ်တစ်ခုရှိပြီး နောက်တစ်ခုတွင် နှစ်ဆတက်သည်။အဓိပ္ပာယ်မရှိ၊ တောင်ထွတ်တစ်ခုတည်းက ကောင်းတာပေါ့။ဒါအမှန်ပဲလား။
Dou E ထက် ပိုဆိုးတာက အောက်မှာ ပုံနှစ်ခုကို ထည့်လိုက်ရင် ချက်ခြင်း နားလည်သွားလိမ့်မယ်။တကယ်တော့ ဒီလိုပုံမျိုးကြောင့် ကျွန်တော်တို့ အလွယ်တကူ လေဖြတ်နေရတယ်။ဂရုတစိုက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်- ပထမပုံ၏အထွတ်အထိပ်သည် ၇၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင်ရှိပြီး၊ ၎င်းသည် လုံးဝ primer dimer ဖြစ်သည်။ဒုတိယပုံ၏အထွတ်အထိပ်သည် 75°C နှင့် 82°C တွင်ပေါ်လာသည်၊ အနည်းဆုံး ထုတ်ကုန်ပေါ်လာသည်။
ကျောင်းသားများထံမှ တုံ့ပြန်မှုပုံရိပ်များ
ဒါကြောင့် အခြေခံပြဿနာက ဓာတ်ပစ္စည်းတွေရဲ့ ပြဿနာမဟုတ်ဘဲ primer ဒီဇိုင်းပြဿနာပါ။တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ အချို့သော ကုန်အမှတ်တံဆိပ်ကြီးများသည် သံအရည်အသွေးမဟုတ်ကြောင်းကိုလည်း သက်သေပြခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် ကျွန်ုပ်၏အစ်ကိုရှေ့တွင် ပြောခဲ့သည့်အရာကို သက်သေပြသည်- ၎င်းသည် သင့်ဆောင်းပါးကို ပံ့ပိုးပေးသည့် ဓာတ်ပစ္စည်းများမဟုတ်ပေ။သင့်ဆောင်းပါးသည် ဓာတ်ပစ္စည်းများ၏ အမှတ်တံဆိပ်ကို မြှင့်တင်ပေးသည့် ဆောင်းပါးဖြစ်သည်။စိတ်ကူးယဉ်ကြည့်ပါ၊ အကယ်၍ လူသည် ဓာတ်ပစ္စည်းများကို မပြောင်းလဲခဲ့ပါက၊ မှားယွင်းသော အချက်အလက်များကို ဂျာနယ်သို့ ပေးပို့မည်ဖြစ်ပြီး၊ အဘယ်အရာသည် ကြေကွဲဖွယ်ဖြစ်မည်နည်း။
ထိန်းချုပ်မှုအလွတ်၏ 2. Ct တန်ဖိုး
အလွတ်ထိန်းချုပ်မှုတွင် Ct တန်ဖိုးရှိလျှင် ၎င်းသည် ညစ်ညမ်းမှုမဟုတ်ဟု မရှင်းပြပါနှင့်။သို့သော်၊ မည်သည့် blank control တွင် Ct တန်ဖိုးရှိသည်ကို သင်နားလည်ရန် လိုအပ်သေးသည်။၎င်းသည် NTC ဖြစ်ပါက၊ ဓါတ်ပြုခြင်း ညစ်ညမ်းခြင်းကဲ့သို့သော နိုင်ငံခြား DNA ရှိသည်ဟု ဆိုလိုသည်။NRT ဖြစ်ပါက၊ ထုတ်ယူထားသော RNA တွင် DNA ညစ်ညမ်းမှုရှိသည်ဟု ဆိုလိုသည်။
3. စံမျဉ်းကွေး
slope နှင့် calculation formula အပါအဝင် PCR efficiency ကို ဖော်မြူလာဖြင့် တွက်ချက်နိုင်ပါသည်။ပြီးပြည့်စုံသောစမ်းသပ်မှုတစ်ခုသည် 3.32 သို့ချဉ်းကပ်ရန် စံမျဉ်းကွေး၏ စောင်းနှင့် R² 0.9999 သို့ချဉ်းကပ်ရန် လိုအပ်သည်။
4. Linear dynamic range
တုံ့ပြန်မှု၏ ဒိုင်းနမစ်အကွာအဝေးသည် linear ဖြစ်သည်။စံမျဉ်းကွေးကို ထုတ်လုပ်ရန် အသုံးပြုသည့် နမူနာပုံစံအရ၊ ဒိုင်နမစ်အကွာအဝေးတွင် အနည်းဆုံး အာရုံစူးစိုက်မှုအဆင့်အတန်းအစား 5 ခု ပါဝင်သင့်ပြီး အာရုံစူးစိုက်မှုမြင့်မားသော gradients နှင့် low concentration gradients များတွင် Ct တန်ဖိုးများ ပြောင်းလဲခြင်းကို အာရုံစိုက်သင့်သည်။
5. ထောက်လှမ်းတိကျမှု
qPCR ရလဒ်များတွင် ပြောင်းလဲမှုများ၊ ဆိုလိုသည်မှာ ထပ်တလဲလဲနိုင်မှု ညံ့ဖျင်းခြင်း၊ ဆိုလိုသည်မှာ တိကျမှု ညံ့ဖျင်းခြင်း၊ အပူချိန်၊ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် လည်ပတ်ဆောင်ရွက်မှုတို့အပါအဝင် အချက်များစွာကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းဖြစ်သည်။qPCR တိကျမှုသည် ယေဘုယျအားဖြင့် မိတ္တူအရေအတွက် လျော့နည်းလာသည်နှင့်အမျှ ထိန်းချုပ်မှု နည်းပါးလာသည်။အကောင်းဆုံးသော စမ်းသပ်မှုအတွင်း ကွဲလွဲချက်၊ ဤနည်းပညာပိုင်းဆိုင်ရာ ကွဲလွဲမှုသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ကွဲလွဲချက်များနှင့် ကွဲပြားသင့်ပြီး ဇီဝပုံစံတူများသည် အုပ်စုများ သို့မဟုတ် ကုသမှုများကြား qPCR ရလဒ်များ၏ ကိန်းဂဏန်းကွဲပြားမှုများကို တိုက်ရိုက်ဖြေရှင်းနိုင်ပါသည်။အထူးသဖြင့် ရောဂါရှာဖွေရေး စစ်ဆေးမှုများအတွက်၊ ဆိုက်များနှင့် အော်ပရေတာများတစ်လျှောက် အကောင်းဆုံး အပြန်အလှန် တိကျမှု (ထပ်တလဲလဲနိုင်မှု) ကို အစီရင်ခံရပါမည်။
6. ထောက်လှမ်းမှု ထိရောက်မှုနှင့် LOD ( multiplex qPCR တွင်)
LOD သည် တွေ့ရှိသော အပြုသဘောနမူနာ ၉၅% ၏ အနိမ့်ဆုံးအာရုံစူးစိုက်မှုဖြစ်သည်။တစ်နည်းဆိုရသော်၊ ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇပုံတူများအစုအတွင်းပါရှိသော LOD ၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည် မအောင်မြင်သောတုံ့ပြန်မှုများ၏ 5% ထက်မပိုသင့်ပါ။multiplex qPCR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း အထူးသဖြင့် point mutations သို့မဟုတ် polymorphisms များကို တပြိုင်နက်တည်း ထောက်လှမ်းခြင်းအတွက် multiplex qPCR သည် တူညီသောပြွန်တွင် အပိုင်းအစများစွာ၏ တိကျမှုကို အလျှော့မပေးကြောင်း၊ အများအပြား ထောက်လှမ်းမှုနှင့် single tube detection Efficiency နှင့် LOD တို့သည် အတူတူပင်ဖြစ်သင့်သည်။အထူးသဖြင့် အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားသော ပစ်မှတ် ဗီဇနှင့် အာရုံစူးစိုက်မှု နည်းပါးသော ပစ်မှတ် ဗီဇများကို တစ်ပြိုင်နက် ချဲ့ထွင်သောအခါ၊ ဤပြဿနာကို အာရုံစိုက်ရပါမည်။
ပြဿနာများနှင့် ဖြေရှင်းချက်များယေဘူယျအားဖြင့်၊ qPCR အမှားရှာပြင်ခြင်းတွင် မကြာခဏကြုံတွေ့ရသည့် ပြဿနာများသည် အောက်ပါကဏ္ဍများကို အာရုံစိုက်သည်-
· အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်
· primer အာရုံစူးစိုက်မှုရွေးချယ်ရခက်ခဲပြီး primer-dimer နှင့်ပြဿနာ
· လိမ်းထားသော အပူချိန်သည် မမှန်ပါ။
· အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်အပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသည်။
အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်
အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်Primer ဒီဇိုင်းသည် သင့်လျော်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ ယေဘုယျအားဖြင့် ယူဆနိုင်သော်လည်း primer များကို ပြောင်းလဲရန် အလျင်စလိုမလုပ်ပါက အောက်ပါနည်းလမ်းများကို ဦးစွာ စမ်းသုံးနိုင်သည် (နိယာမကိုလည်း ပူးတွဲပါရှိသည်)။
· annealing အပူချိန်ကိုတိုးပေးပါ - အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို မထိန်းသိမ်းနိုင်စေရန် ကြိုးစားပါ။
· annealing and elongation time ကို တိုစေသည် - အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများ ဖြစ်နိုင်ခြေကို လျှော့ချပါ။
· primer အာရုံစူးစိုက်မှုကိုလျှော့ချပါ - မလိုအပ်သော primer များနှင့်ပစ်မှတ်မဟုတ်သောနေရာများကိုပေါင်းစပ်နိုင်ခြေကိုလျှော့ချပါ။
အသံချဲ့စက် စွမ်းဆောင်ရည် နိမ့်သည်။
အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်နှင့် ဆန့်ကျင်ဘက် အခြေအနေ - ချဲ့ထွင်မှု နည်းပါးသော ထိရောက်မှု နှင့် ချဲ့ထွင်မှု စွမ်းဆောင်ရည် နိမ့်ကျမှုကို ကိုင်တွယ်ရန် အစီအမံများသည် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်သည်-
· annealing နှင့် elongation အချိန်ကို ရှည်စေခြင်း၊
· အဆင့်သုံးဆင့် PCR သို့ပြောင်းပြီး လိမ်းထားသော အပူချိန်ကို လျှော့ချပါ။
· primer အာရုံစူးစိုက်မှုကိုတိုးမြှင့်;
Ps: 90s တွင်မွေးဖွားသော ဘွဲ့ရကျောင်းသားအများစုသည် အမှားရှာစမ်းသပ်နည်းကို မလေ့လာလိုကြဘဲ အစုံလိုက်သည် ပြဿနာကို လုံးလုံးဖြေရှင်းနိုင်မည်ဟု မျှော်လင့်ကြသည် (ကျောင်းဆင်းပြီးနောက် သုတေသနနှင့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုပြုလုပ်ရန် reagent ကုမ္ပဏီသို့သွားလိုပါက)၊ တကယ်တော့၊ ဓါတ်ဆေးထုတ်လုပ်သူများသည်လည်း ဤနည်းအတိုင်းတွေးကြသည်၊ ၎င်းကိုရသောအခါတွင် ၎င်းကိုသုံးနိုင်သည်ဟု မျှော်လင့်ပါသည်၊ ထို့ကြောင့် reagent ထုတ်လုပ်သူများသည် ပြဿနာများစွာကို ဖြေရှင်းရန် အားနည်းသောအပါအ ၀ င် reagent plcpe ကိုသုံးစွဲခဲ့ကြပါသည်။ -bond စုပ်ယူမှုအချက်များ။ပြဿနာကို လွယ်ကူစွာဖြေရှင်းရန်၊ လူမိုက်များသည် အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို စုပ်ယူနိုင်သည့် အကြောင်းရင်းရှိမရှိ သိရှိရန် ဓာတ်ကူပစ္စည်းကုမ္ပဏီ၏ နိဒါန်းကို ဖတ်ရသေးသည်။
primer အာရုံစူးစိုက်မှုရွေးချယ်ရခက်ခဲပြီး primer-dimer နှင့်ပြဿနာ
နည်းလမ်း ၁: ယေဘုယျအားဖြင့် ပြောရလျှင် qPCR အတွက် အစုံအလင် ညွှန်ကြားချက်များတွင် အကြံပြုထားသော စနစ်များနှင့် အကြံပြုထားသော primer ပါဝင်မှု ရှိသည်။
နည်းလမ်း ၂: primer အာရုံစူးစိုက်မှု gradient ကို သတ်မှတ်ခြင်းဖြင့် အမှားရှာခြင်းအောက်ဖော်ပြပါပုံသည် ကုမ္ပဏီတစ်ခုမှ ခိုးယူခံရသည်ကို သရုပ်ဖော်သည်။အောက်ဖော်ပြပါပုံသည် primer concentration gradients (100nM, 250nM, 500nM) နှင့် template concentration gradients လေးခု (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ဖြင့်ပြုလုပ်ထားသော fluorescence အရေအတွက်ရလဒ်များကို ပြသထားသည်။စမ်းသပ်ရလဒ်များ၏ Ct တန်ဖိုးကို အောက်ပါအတိုင်း ရေးဆွဲထားသည်။
Primer Concentration Selection သည် primer အာရုံစူးစိုက်မှုတစ်ခုစီကို အောက်ပါအတိုင်းမျဉ်းအဖြစ် ပေါင်းထည့်ပါ ။
primer အာရုံစူးစိုက်မှုရွေးချယ်မှုသည်ထင်ရှားသည်၊၊ primer အာရုံစူးစိုက်မှု 100nM နှင့် 250nM ၏ linear ဆက်ဆံရေးသည်ပိုမိုကောင်းမွန်သည်၊ နှင့် 500nM ၏ primer concentration ၏ linear ဆက်ဆံရေးသည်အတော်လေးညံ့ဖျင်းသည်။100nM နှင့် 250nM တွင်၊ 250nM ၏ Ct တန်ဖိုးသည် အတော်လေးသေးငယ်သည်၊ ထို့ကြောင့် အကောင်းဆုံး primer အာရုံစူးစိုက်မှုသည် 250nM ဖြစ်သည်။ယေဘူယျအားဖြင့် ပြင်းထန်သော primer-dimers များကို အရည်ပျော်မျဉ်းကြောင်းတွင် တွေ့နိုင်ပါသည်။ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော primer များသည် primer-dimer များကို မရှောင်နိုင်ပါက မည်သို့နည်း။
နည်းလမ်း ၃: primers ပမာဏကို လျှော့ချပြီး annealing temperature ကို တိုးပေးပါ (ရှင်းပြရန်မလိုအပ်ပါ)။
annealing temperature ၏ ပင်ကိုယ်တန်ဖိုးသည် 60°C ဖြစ်သည်။သင်မသေချာပါက၊ ပိုမိုသင့်လျော်သော annealing အပူချိန်ကိုမည်သို့ရွေးချယ်မည်နည်း။အဖြေကတော့ primer concentration ရွေးချယ်တာနဲ့ အတူတူပါပဲ-gradient စမ်းသပ်မှု.ပြဿနာကိုဖော်ပြရန် Bio-rad ကုမ္ပဏီမှ ဓာတ်ပုံတစ်ပုံကို ယူပါ။သတ်မှတ်ထားသော ပစ်မှတ်အပိုင်းအစတစ်ခု၏ ချဲ့ထွင်ရန်အတွက်၊ တစ်ခုချင်းစီကို ထပ်ခါတလဲလဲ သုံးကြိမ်ဖြင့် အပူချိန် ရှစ်ခုကို သတ်မှတ်ပြီး ရရှိထားသော ချဲ့ထွင်မှုမျဉ်းကွေးမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်-
annealing အပူချိန်ရွေးချယ်မှု:
· 70°C၊ 69°C—အခြေခံအားဖြင့် primer များကို ပေါင်းစပ်၍မရသောကြောင့် အသံချဲ့ထွင်မှု မရှိပါ။
· 67.3°C – အစပိုင်းတွင် ချဲ့ထွင်မှုပမာဏ အနည်းငယ်ရှိပြီး Ct တန်ဖိုးသည် အတော်လေးကြီးမားသည်။
· 64.5°C — Ct တန်ဖိုး ကျဆင်းသွားသည်။
· 60.7°C၊ 58.0°C၊ 56.2°C နှင့် 55.0°C တွင်၊ Ct တန်ဖိုးများသည် အခြေခံအားဖြင့် တည်ငြိမ်နေသော်လည်း နောက်ဆုံး fluorescence တန်ဖိုးများ ကွဲပြားပါသည်။
ဘယ်လိုရွေးချယ်ရမလဲ?Principle- ပထမနိယာမမှာ Ct တန်ဖိုး ပိုမြင့်သည်။တူညီသော Ct တန်ဖိုးအတွက်၊ အမှေးမှိန်ခြင်း နှင့် သီးခြားမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် ပိုမိုမြင့်မားသော အပူချိန်ကို ရွေးချယ်ပါ။55°C တွင် ပိုမိုမြင့်မားသော fluorescence တန်ဖိုးရှိသော်လည်း၊ ၎င်းတွင် dimers သို့မဟုတ် သီးခြားမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်များ ရှိနိုင်ပါသည်။
ဒါပေမယ့် မင်းလိုပဲ ထက်မြက်တယ်ဆိုရင်တော့ သေချာပေါက်ထင်လိမ့်မယ်- ယုတ္တိနည်းအရပြောရရင် PCR တုံ့ပြန်မှုက အရမ်းတိကျနေတယ်ဆိုရင် primer အာရုံစူးစိုက်မှုဟာ အနိမ့်ဆုံးလိုအပ်ချက်ထက်ကျော်လွန်နေသရွေ့၊ မြင့်မားတဲ့အမှတ်တွေဟာ fluorescent dyes နဲ့ dNTPs တွေလိုမျိုး အကျိုးသက်ရောက်မှု မရှိသင့်ပါဘူး။အမှန်မှာ၊ annealing temperature ကို မှန်ကန်စွာ ချိန်ညှိထားသရွေ့၊ primer concentration ၏ Ct တန်ဖိုးအပေါ် သဘာဝအတိုင်း လျော့နည်းသွားမည်ဖြစ်ပါသည်။
annealing temperature ကို မှန်ကန်စွာ ချိန်ညှိထားပြီး CT တွင် primer အာရုံစူးစိုက်မှု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို လျှော့ချပါမည်။
အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်အပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသည်။
ပြဿနာကို သရုပ်ဖော်ရန် Bio-rad မှ ဓာတ်ပုံကို ယူလိုက်ကြပါစို့။အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံပါရှိသော မျိုးဗီဇကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက်လည်း အပူချိန် gradient ကို ဒီဇိုင်းထုတ်ပါသည်။
အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံ ပေါ်ပေါက်လာသည်။
အပူချိန် gradient လျော့နည်းလာသည်နှင့်အမျှ ထုတ်ကုန်များပေါ်လာပြီး Ct တန်ဖိုးသည် ရှေ့သို့ရွေ့လျားကာ အနိမ့်ဆုံးတန်ဖိုး 60.7°C သို့ရောက်ရှိပြီးနောက် အပူချိန် gradient လျော့နည်းလာသည်နှင့်အမျှ Ct တန်ဖိုးသည် ပိုကြီးလာသည်ကို တွေ့မြင်နိုင်သည်။အပြန်အလှန်အားဖြင့် အပူချိန်တိုးလာသည်နှင့်အမျှ အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံသည် ပွင့်လာပြီး ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှု တိုးလာသည်။သတ်မှတ်ထားသော အပူချိန်သို့ ရောက်ပြီးနောက်၊ အပူချိန်တိုးခြင်းသည် အသံချဲ့စက်၏ စွမ်းဆောင်ရည်ကို မြှင့်တင်မပေးနိုင်ပါ။ဘာကြောင့်လဲဆိုတော့ ဒီအချိန်မှာ primer တွေကို တည်ငြိမ်စွာ ပေါင်းစပ်လို့မရနိုင်လို့ပါ။ထို့ကြောင့်၊အနိမ့်ဆုံး Ct တန်ဖိုးဖြင့် အပူချိန်ကို ရှာပါ။အလယ်တန်းပုံစံပုံစံကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် အကောင်းဆုံးအပူချိန်ဖြစ်သည်။မလိုအပ်ရင် primers ကိုပြောင်းပြီး အလယ်တန်းဖွဲ့စည်းပုံနေရာကို ရှောင်တာ အကောင်းဆုံးပါပဲ၊ စမတ်ကျတဲ့လူမိုက်တွေက သိထားရမယ်။
5. လျှောက်လွှာအဆင့်
MIQE—ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။
ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အဓိကအားဖြင့် fluorescent quantitative PCR ကိရိယာဖြင့် ပေးသည်။ယခင်ဆောင်းပါးတွင်၊ စမ်းသပ်မှုဒီဇိုင်းတွင် ရှင်းပြထားသည့် ဗလာထိန်းချုပ်မှုကဲ့သို့သော ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုလုပ်ငန်းအများအပြားကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီးဖြစ်သည်။အတွင်းအကိုးအကား ဗီဇ၊ ထပ်တလဲလဲ နံပါတ်များ စသည်တို့ကို ရှင်းလင်းထားသည်။ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် qPCR ၏လျှောက်လွှာကို အဓိကအားဖြင့် ရှင်းပြပါသည်။
qPCR ကို တွင်ကျယ်စွာအသုံးပြုထားပြီး စမ်းသပ်စစ်ဆေးခြင်း နှင့် nucleic acid ရောဂါရှာဖွေခြင်းများသည် အသုံးအများဆုံးအခြေအနေများဖြစ်သည်။
ပကတိပမာဏ
မှတ်တမ်း (ကနဦးအာရုံစူးစိုက်မှု) သည် သံသရာအရေအတွက်နှင့် တူညီသော ဆက်နွယ်မှုရှိသည်။စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုအား သိရှိထားသော ကနဦးမိတ္တူနံပါတ်ဖြင့် စံတစ်ခုမှ ထုတ်ယူနိုင်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ ချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှု၏ မျဉ်းကြောင်းဆက်နွယ်မှုကို ရရှိနိုင်သည်။နမူနာ၏ Ct တန်ဖိုးအရ၊ နမူနာရှိ အာရုံစူးစိုက်မှုကို တွက်ချက်နိုင်သည်။ပါဝင်သော ပုံစံများ ပမာဏ။
အကြွင်းမဲ့ အရေအတွက် တွက်ချက်နည်း
အကြွင်းမဲ့ ပမာဏသည် စံမျဉ်းကွေးပေါ်တွင် အခြေခံရပါမည်။စံမျဉ်းကွေးတစ်ခု ပြုလုပ်ရန်၊ စံတစ်ခု လိုအပ်သည်။အများအားဖြင့်၊ စံသည် ပစ်မှတ်ဗီဇကိုပွားခြင်းဖြင့် ရရှိသော ပလတ်စမစ်တစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်းသည် အဘယ်ကြောင့် ပလတ်စမစ်ဖြစ်သနည်း။အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် စက်ဝိုင်းရှိ ပလတ်စမစ် DNA သည် အတည်ငြိမ်ဆုံးဖြစ်သည်။စံထုတ်ကုန်ကို 5 မှ 6 အထိ gradients နှစ်ဆ (10-ဆ အရောအနှော) အချိုးအရ ရောမွှေပြီး ဖျန်းသည့်အခါ တူညီမှုကို ဂရုပြုပါ။Ct တန်ဖိုး 15-30 အကြား ကျဆင်းပါစေ။
စံပြင်ဆင်မှု
တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ စမ်းသပ်မည့်နမူနာကိုလည်း လျော်ညီစွာ ရောနှောထားသင့်သည် (အဖျော့ဖျော့ဖျော့ကို သတိရပါ)၊ Ct တန်ဖိုးသည်လည်း 15-30 အကြား ကျဆင်းသင့်သည်။စံထုတ်ကုန် + စမ်းသပ်ရမည့်နမူနာကို စက်ပေါ်တွင် တွဲတင်ထားသည်။ပြေးပြီးနောက်၊ စံမျဉ်းကွေးကို စံဓာတ်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး အာရုံစူးစိုက်မှုကို တွက်ချက်ရန်အတွက် စမ်းသပ်ရမည့် နမူနာများကို စံမျဉ်းကွေးသို့ ယူဆောင်လာခဲ့သည်။
Hepatitis B virus HBV quantification သည် ပုံမှန် absolute quantification ဖြစ်ပြီး၊ virus copy number ကို သွေး 1ml တွင် တွက်ချက်နိုင်ပါသည်။
မိတ္တူနံပါတ် တွက်ချက်ခြင်း။
စမ်းသပ်မည့်နမူနာ အာရုံစူးစိုက်မှု (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × ဖျော့ဖျော့အချက်
နမူနာ မော်လီကျူးအလေးချိန် = ခြေစွပ်အရေအတွက် × 324
စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏မိတ္တူနံပါတ် (မိတ္တူ/ul) = စမ်းသပ်မည့်နမူနာ၏ အာရုံစူးစိုက်မှု / နမူနာ၏ မော်လီကျူးအလေးချိန် × 6 × 1014
မိတ္တူ ဂဏန်းတွက်နည်း
အထက်ပါအချက်သည် ပမာဏကိုဆုံးဖြတ်ရန် တွက်နည်းဖြစ်သည်။ဤသည်မှာ အလယ်တန်းကျောင်းမှ ဘွဲ့ရပြီးနောက် ဖြေရှင်းနိုင်သော သင်္ချာပြဿနာဖြစ်ပြီး သင်္ချာပုစ္ဆာများကို ယေဘုယျအားဖြင့် ကွန်ပျူတာများဖြင့် ဖြေရှင်းနိုင်သည်။နားမလည်ပါက လာရောက်ဆက်သွယ်နိုင်ပါသည်။
ဆွေမျိုးအရေအတွက်
Relative Quantification ကို သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနတွင် အဓိကအားဖြင့် အသုံးပြုပါသည်။သွေး 1ml တွင် ဗိုင်းရပ်စ် မည်မျှရှိသနည်း၊ ၎င်းသည် DNA ဗိုင်းရပ်စ်ဖြစ်သည်၊ ၎င်းသည် အတော်လေး အဆုံးအဖြတ်ပေးသည့် ဖြစ်ရပ်ဖြစ်သည်- သွေးပမာဏကို ဆုံးဖြတ်နိုင်ပြီး DNA ဗိုင်းရပ်စ်သည် အတော်လေး တည်ငြိမ်ပါသည်။သို့သော်၊ အရွက်၏ အရွယ်အစား၊ အလေးချိန်၊ နူးညံ့မှုတို့ကို ဆုံးဖြတ်ရန်ခက်ခဲသောကြောင့် အရွက်ရှိ မျိုးဗီဇတစ်ခု၏ ကူးယူဖော်ပြမှု အရေအတွက်ကို နှိုင်းယှဉ်ရန် ခက်ခဲသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် အရွက်၏ အရွယ်အစား၊ အလေးချိန်၊ နူးညံ့မှု၊ ထုတ်ယူထားသော RNA ပမာဏကို ဆုံးဖြတ်ရခက်ပြီး ပြောင်းပြန်ကူးယူခြင်း၏ ထိရောက်မှုမှာလည်း ဆုံးဖြတ်ရခက်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ မည်သည့်အဆင့်သည် စမ်းသပ်ဒေတာကို ချို့ယွင်းချက်ဖြစ်စေ၍ အသုံးမပြုနိုင်ပေ။
ထို့ကြောင့် နှိုင်းရအရေအတွက် သတ်မှတ်ချက်သည် ဒြပ်စင်တစ်ခုကို မိတ်ဆက်ပေးရပါမည်-အတွင်းရည်ညွှန်းဗီဇ။
တစ်နည်းဆိုရသော် Relative quantification သည် အမှန်တကယ်ပင် ပစ်မှတ် gene နှင့် internal reference gene အကြား နှိုင်းယှဉ်ချက်ဖြစ်သည်။တူညီသောတစ်ရှူးများနှင့် တူညီသောဆဲလ်များတွင် နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ နမူနာအရွယ်အစား၊ RNA ထုတ်ယူမှုပမာဏ၊ ပြောင်းပြန်ကူးယူဖော်ပြမှု ထိရောက်မှုနှင့် PCR ထိရောက်မှုတို့သည် နည်းပါးပါသည်။သေးငယ်သောနမူနာအရွယ်အစားကြောင့်၊ အတွင်းရည်ညွှန်းဗီဇနှင့် ပစ်မှတ်မျိုးဗီဇ နှစ်ခုစလုံးသည် အတော်လေး လျော့ကျသွားခဲ့သည်။အဲဒါကြောင့် စည်းလုံးညီညွတ်မှုနဲ့ တည်ငြိမ်မှုကို ကျွန်တော်တို့ အရင်က အလေးထားပြီး လုပ်ခဲ့တာပါ။
Internal reference genes များသည် ယေဘူယျအားဖြင့် ဖြစ်သည်။အိမ်ထိန်းဗီဇ(house-keeping genes) သည် ဆဲလ်အားလုံးတွင် တည်ငြိမ်စွာဖော်ပြသည့် ဗီဇအမျိုးအစားကို ရည်ညွှန်းပြီး ၎င်းတို့၏ ထုတ်ကုန်များသည် ဆဲလ်များ၏ အခြေခံဘဝလှုပ်ရှားမှုများကို ထိန်းသိမ်းရန် လိုအပ်ပါသည်။
ဒီသဘောတရားကို မရောထွေးပါနဲ့။နေရာထိုင်ခင်းထိန်းသိမ်းခြင်း ဗီဇများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ဝေါဟာရများဖြစ်ပြီး အတွင်းပိုင်းအကိုးအကား ဗီဇများသည် စမ်းသပ်နည်းပညာဆိုင်ရာ ဝေါဟာရများဖြစ်သည်။နေရာထိုင်ခင်းထိန်းသိမ်းသည့် ဗီဇများသည် ၎င်းတို့ကို အတွင်းပိုင်းကိုးကားသည့် ဗီဇများအဖြစ် မရွေးချယ်မီ အတည်ပြုချက်ကို အတည်ပြုရန် လိုအပ်သည်။
ဥပမာအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မတူညီသောတစ်ရှူးဆဲလ်များရှိ ၎င်းတို့၏ဖော်ပြမှုအဆင့်များကို စမ်းသပ်ရန်အတွက် အောက်ဖော်ပြပါပုံရှိ အိမ်တွင်းရေးဗီဇများစွာကို ရွေးချယ်ခဲ့ပြီး β-2-microglobulin ၏ဖော်ပြမှုအဆင့်သည် အခြားဗီဇသုံးမျိုးတို့နှင့် အလွန်ကွာခြားသည်ကို တွေ့ရှိသောကြောင့် ၎င်းတို့ကို အတွင်းပိုင်းအညွှန်းဗီဇအဖြစ် အသုံးမပြုနိုင်ပါ။
အတွင်းအကိုးအကား ဗီဇ၏ တည့်မတ်မှု လုပ်ဆောင်ချက်ကို နားလည်ပြီးနောက်၊ အတွင်းအကိုးအကား ဗီဇ၏ နိဒါန်းကြောင့် algorithms နှစ်ခု ဆင်းသက်လာပါသည်။
· နှစ်ထပ်စံမျဉ်းကွေးနည်းလမ်း
· 2 – △△ Ct နည်းလမ်း (CT တန်ဖိုး နှိုင်းယှဉ်နည်း)
မျိုးစိတ်များနှင့် ဗီဇလုပ်ဆောင်ချက်များကို လေ့လာရန် စိတ်ဝင်စားပါက အယ်ဂိုရီသမ်များဆိုင်ရာ သုတေသနကို စွန့်လွှတ်ပြီး ဖော်မြူလာများကို တိုက်ရိုက်အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် စက်များကို တိုက်ရိုက်အသုံးပြုပါ။သင်ဟာ သင်္ချာနဲ့ အင်ဂျင်နီယာဘာသာရပ်မှာ ရိုးဖြောင့်သူတစ်ယောက်ဆိုရင် ကျေးဇူးပြုပြီး အားမနာပါနဲ့။
နှစ်ထပ်စံမျဉ်းကွေးနည်းလမ်း
ထိန်းချုပ်နမူနာ၏ ပစ်မှတ်မျိုးရိုးဗီဇနှင့် အိမ်စောင့်ဗီဇတို့ကို စံမျဉ်းကွေးဖြင့် စမ်းသပ်ရမည့်နမူနာကို တွက်ချက်ပြီး နှိုင်းယှဥ်ဖော်ပြမှုအဆင့်ဖြစ်သည့် တွက်ချက်ပုံသေနည်းအရ ဆွေမျိုးတန်ဖိုးကို တွက်ချက်ပါ။
အားသာချက်များ- ရိုးရှင်းသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ ရိုးရှင်းသော စမ်းသပ်မှု ပိုမိုကောင်းမွန်အောင် ပြုလုပ်ခြင်း။
အားနည်းချက်- မျိုးရိုးဗီဇတစ်ခုစီအတွက်၊ စမ်းသပ်မှုအကြိမ်တိုင်းသည် စံမျဉ်းကွေးတစ်ခု ပြုလုပ်ရပါမည်။
အပလီကေးရှင်း- မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြခြင်းဆိုင်ရာ စည်းမျဉ်းကို လေ့လာရာတွင် အသုံးအများဆုံးနှင့် အသိအမှတ်ပြုထားသော နှိုင်းရအရေအတွက်နည်းများထဲမှ တစ်ခု။
ဖော်မြူလာမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်။
ဥပမာများမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်-
အရေအတွက်ရလဒ်ပေါ်မူတည်၍ ဆွေမျိုးပမာဏကို တွက်ချက်ပါ။
2 – △△ Ct နည်းလမ်း (CT တန်ဖိုး နှိုင်းယှဉ်နည်း)
အားသာချက်များ- စံမျဉ်းကွေးလုပ်ရန် မလိုအပ်ပါ။
အားနည်းချက်များ- amplification efficiency သည် 100% နီးပါးရှိသည်ဟု ယူဆပါသည်။စံသွေဖည်မှုသည် < 5% ဖြစ်ပြီး၊ စံမျဉ်းကွေးနှင့် ချဲ့ထွင်မှုတစ်ခုစီကြားရှိ ထိရောက်မှုသည် တသမတ်တည်းဟု ယူဆပါသည်။စမ်းသပ်မှုအခြေအနေများကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းသည် ပိုမိုရှုပ်ထွေးပါသည်။
အပလီကေးရှင်း- မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြခြင်းဆိုင်ရာ စည်းမျဉ်းကို လေ့လာရာတွင် အသုံးအများဆုံးနှင့် အသိအမှတ်ပြုထားသော နှိုင်းရအရေအတွက်နည်းများထဲမှ တစ်ခု။
ဟုတ်ပါတယ်၊ ချဲ့ထွင်မှုထိရောက်မှုဟာ ပုံမှန်အားဖြင့် လုံးဝမဖြစ်နိုင်ပါဘူး 1. ပြုပြင်ခြင်းနည်းလမ်း- ပစ်မှတ်ဗီဇနှင့် ရည်ညွှန်းဗီဇသည် တူညီသော ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့သိပါက၊ သို့သော် ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်သည် 1 နှင့် ညီမျှခြင်းမရှိပါ၊ ထို့နောက် 2－△△Ct ကို ပြုပြင်နိုင်သည်- (1+E )－△△ Ct သည် မှန်ကန်လျှင် 9 ဖော်မြူလာဖြစ်လျှင် ထိရောက်မှုဖြစ်နိုင်သည်။ 1.95－△△ Ct
ယခုအချိန်အထိ၊ fluorescent quantitative PCR နှင့်ပတ်သက်သည့်အကြောင်းအရာသည် အဆုံးတိုင်သွားပါပြီ။
ပို့စ်အချိန်- ဧပြီ- ၀၆-၂၀၂၃
